温州地区180名10周岁儿童CYP3A酶活性分布

; 作者：林光勇，周严灿，王增寿，路黎 毕业论文。

【摘要】; 目的：调查温州地区180名10周岁儿童细胞色素P450 3A酶活性（cytochrome P450 3A activity，CA）的分布情况及正常值范围。方法：采用HPLC梯度洗脱法测定尿液中氢化可的松和6β?羟基氢化可的松浓度，以6β?羟基氢化可的松与氢化可的松的浓度之比来表示CYP3A酶的活性。结果：180名10周岁儿童CA分布不呈正态分布，变异系数为2.96，变异系数的标准误为0.13，偏度系数1。受检者CYP3A酶的平均活性为（4.8±1.9），其中男孩为（4.4±1.6），女孩为（5.1±1.9）。温州地区10周岁儿童CYP3A酶的活性无性别差别，正常范围值是0.85～21.52。结论：通过对180名10周岁儿童CYP3A酶活性的测定，推断出该年龄正常值范围，可为制定儿童个体化给药方案提供科学依据。

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【关键词】; 细胞色素P450 3A酶；6β?羟基氢化可的松；氢化可的松；儿童；分布；尿液。

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细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是人体内代谢药物的主要酶系，其中CYP3A参与人体大约50%以上的药物代谢，其活性改变可使药物的动力学产生个体化差异［1］。CYP3A有4种亚型：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。CYP3A4和CYP3A5是CYP在人体内的主要亚型，CYP3A4主要存在于肝脏和肠道，占CYP总量的30%～40%，CYP3A5主要存在于肾脏，对药物代谢的影响能力较CYP3A4小得多［2］。CYP3A7主要在于婴儿期，而CYP3A43对药物的代谢的影响最小［3］。CYP3A活性（CYP3A aetivity，CA），通常是指CYP3A4、CYP3A5和CYP3A43的活性总和。在测定CA方面，氢化可的松法［4］是近年来应用较多、也较为安全的一种方法。氢化可的松法将人尿中6β?羟基氢化可的松和氢化可的松的含量比值作为衡量CYP3A活性的生物探针已得到许多学者的认可［3?5］。本实验采用HPLC梯度洗脱法测定180名10周岁健康儿童24 h尿液中氢化可的松（hydrocortisone，HC）及其代谢产物6β?羟基氢化可的松（6β?hydroxycortisol，6β?OHC）的含量，计算其比值来衡量CYP3A的表型活性，旨在了解该年龄段儿童中CA的分布情况。 毕业论文。

1; 仪器及试药 ; 　　　　HP1100 HPLC（美国Hewleft?Packand公司），包括：G1311A四元梯度泵，G1322A真空脱气机，G1313A自动进样器，G1317A二维液相工作站。氢化可的松对照品（美国sigma?aldrich公司，批号39L1091），6β?羟基氢化可的松对照品（美国sigma?aldrich公司，批号28L1144）；内标为地塞米松（美国sigma?aldrich公司，批号81K1110）；甲醇、乙腈均为色谱纯；硫酸铵为分析纯（上海金山化工厂，批号20060102），其它试剂为分析纯，水为多重纯化水。 毕业论文。

2; 对象与方法 毕业论文。

2.1; 研究对象 ; 　　　　按学号在温州市鹿城区、平阳县、文成县小学五年级学生中随机选取10周岁健康儿童180名，其中男生88名，女生92名，汉族，无肝肾疾病。在样品收集前2周，所有儿童未服用任何药品及釉子、咖啡因等影响酶活性的药物和食物，尿常规检验指标均正常。

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2.2; 样品的采集与处理 ; 　　　　每位入选儿童留取晨尿10 mL，置于具塞试管内，放入—20 ℃冰箱中待测。取8 mL尿液加入试管中，随后加入0.1 g/L内标液20 μL和1 mol/L的氢氧化钠溶液0.1 mL，振荡30 s后加入3 mL醋酸乙酯?乙醚（4∶1，V/V）混合液，室温下振荡10 min，10 000 r/min离心10 min，去水相，提取有机相，加入2 mL含有饱和硫酸钠的1 mol/L氢氧化钠溶液进行定量洗脱，振荡后10 000 r/min离心10 min，有机相同前再用含有饱和硫酸钠的1%醋酸溶液洗脱后，取有机相4 mL在45 ℃～50 ℃水浴中以氮气流浓缩蒸干，残渣用100 μL甲醇溶解，振荡混合，备用。 毕业论文。

2.3; 测定尿液中氢化可的松和6β?羟基氢化可的松的含量 ; 　　　　采用HPLC内标法测定尿液中氢化可的松和6β—羟基氢化可的松的含量，内标为地塞米松，色谱柱为HP HyrPersil ODS柱（250 mm×4 mm，5 μm），流动相为乙腈（A相）和1%硫酸铵（B相）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长UV 240 nm。流动相梯度洗脱详见表1，取处理完毕的样品20 μL进样，进行色谱分析。表1; 梯度洗脱的程序表（略） 毕业论文。

2.4; 标准曲线的绘制 ; 　　　　分别精密标取HC、6β?OHC适量，用甲醇稀释成1 mg/mL作为储备液，临用前分别配制HC、6β?OHC 50、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL，按“2.2”项下方法处理并进行测定。采用内标法，以色谱峰面积（X）为纵坐标，药物浓度（Y）为横坐标，进行回归，得到标准曲线方程分为HC：Y=4.5641X—0.8672（r=0.9995）；6β?OHC：Y=4.1256X—0.7763（r=0.9996）；按信噪比3，测定HC、6β?OHC的最低检测限为0.5 μg/L。 毕业论文。

2.5; 回收率试验 ; 　　　　将尿液与氢化可的松和6β?羟基氢化可的松配制成10、200、1 200 μg/L的溶液各5份，按“2.2”项的方法处理并测定，将样品与标准尿液峰面积比分别代入标准曲线，所得浓度差值和投入量的比值即为相对回收率，结果见表2。表2; 加样回收率试验结果（略） 毕业论文。

2.6; 酶活性计算 ; 　　　　分别以HC、6β?OHC的色谱峰面积代入各自标准曲线，得到其浓度。CYP3A酶活性=6β?OHC/HC，由于酶活性是两个浓度的比值，所以无单位。 毕业论文。