英山黄花菜叶枯病的病原鉴定及室内药效研究
报告如下。
材与方法 供试菌株利用组织分离法[]从湖北省英山县雷店镇友谊村黄花菜种植基地黄花菜叶片上分离、纯化、保存病菌。
病原菌形态观察和离体回接鉴定将病菌菌块先置马铃薯葡萄糖培养基（ xr gr）[]平板央8 ℃黑暗培养3 观察菌落颜色和形态；并用无菌水洗下培养菌落分生孢子显微镜（X500倒置显微镜）下观察其形态。
湖北省农业科学院济作物研究所蔬菜基地选取健康黄花菜叶片用水冲洗干净用75%乙醇棉球轻擦表面。
无菌操作台上用镊子轻刮叶片表面使其形成微创伤然用无菌打孔器打取5 菌饼置创伤处以接培养基黄花菜叶片对照。
用无菌水打湿无菌纸放入无菌瓷盘将处理叶片放无菌纸上用保鲜膜包裹瓷盘8 ℃培养。
3次重复每天观察并记录是否发病。
3 菌丝生长致死温和适取直径09 菌块5 L离心管不温梯（30、35、0、5、50、55、60、65 ℃）下水浴0 接种平板。
取直径09 菌块移到 ～共9梯培养基平板上平板置8 ℃条件下培养3 测量菌落直径3次重复。
不碳和氮对菌丝生长影响基础培养基采用査彼（zk）培养基硝酸钠00 g、氯化钾050 g、硫酸亚铁00 g、磷酸氢二钾00 g、硫酸镁050 g、蔗糖3000 g、琼脂700 g。
碳用葡萄糖、糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖和可溶性淀粉替代基础培养基碳；氮用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、磷酸二氢铵、硝酸铵和L谷氨酸钠替代基础培养基氮。
5 核糖体基因录隔区R扩增和系统发育树构建采用玻璃纸法培养真菌8 ℃黑暗条件下平板上培养8～7 收集菌丝参照刘少华等[3]报道尿素法提取菌丝。
用真菌特异引物对扩增r基因录隔区（rl rrb r）[]。
碱基序列（5′ GGGGGGG3′）（5′G GG3′）。
R反应体系0 lL μL0 lL氯化镁 μL缓冲液5 μL加0 μlL引物和各05 μL μLq酶 μL模板05 μL用离子水将反应体系补至5 μL。
R反应条件95 ℃预变性 3 ；95 ℃ 30 57 ℃退火 7 ℃延伸 循环35次；7 ℃延伸0。
R产物以%琼脂糖凝胶电泳鉴定检测到600 b左右条带将R扩增产物回收回收片段与克隆体G连接然化至肠杆菌5α感受态细胞进行蓝白斑筛选选取阳性菌落扩培养部分菌液用3（RGGGGGGGGG）进行R扩增凝胶电泳检测并将检测确认含有目片段阳性克隆送到华基因测序公司测序。
将测得基因序列GBk（进行BL比较序列性较高登记菌株作参比菌株。
用LLX 8软件对相似序列进行多序列比对由G 50软件采用邻接法（gbrg）进行系统发育树构建和聚类分析确定菌株微生物系统发育学上地位。
6 药剂抑菌试验供试药剂和使用浓参照供应商推荐浓药剂用无菌水配制。
采用菌丝生长速率法[5]测定药剂抑菌作用以无菌水对照8 ℃恒温培养3 用十交叉法测量菌落直径计算抑制带宽。
每处理重复次。
净生长量菌落直径菌餅直径抑制带宽K净生长量处理净生长量抑菌率K菌落直径处理菌落直径K菌落直径×00% 结与分析 病原菌形态与回接鉴定病原菌培养基上生长速较快菌落近圆形前期白色气生菌丝发达期变灰白色至灰褐色。
8 ℃条件下培养3 显微镜下观察分生孢子单胞直径35 μ左右。
病菌接种 叶片出现病斑失绿黄化随病斑逐渐扩；接种5 叶片出现型病症病斑椭圆形灰白色病健交界处灰褐色具体见图。
菌丝生长适由图可知 、5、6、7、8、9、0、条件下菌落平直径分别70、76、695、733、605、630、57、368。
表明菌丝 ～条件下能正常生长生长适5菌丝 条件下生长速显著慢其他条件下生长速。
3 不碳和氮对菌丝生长影响从图3可以看出病菌对碳利用率高低表现麦芽糖>蔗糖>葡萄糖>可溶性淀粉>甘露醇>糖>α乳糖其麦芽糖作碳菌丝生长显著快其他碳上生长速。
从图可以看出病菌对氮利用率高低表现酵母浸出液>蛋白胨>硝酸钾L谷氨酸钠硝酸钠>硝酸铵>磷酸二氢铵>硫酸铵甘氨酸其氮酵母浸出液菌丝生长显著高其他氮生长速氮甘氨酸或者硫酸铵菌丝生长速显著慢除磷酸二氢铵外其他氮菌丝生长速。
病原菌致死温将菌块置30、35、0、5、50、55、60、65 ℃水浴0 再培养菌丝30～50 ℃条件下处理能正常生长超55 ℃病菌不能生长确定菌丝致死温55 ℃。
5 核糖体基因录隔区R序列与GBk数据库比较分析利用引物和对菌株进行R扩增得到55 b序列把所得病菌序列提交至GBk数据库（GBk序列99688）利用Bl工具与GBk数据库已知微生物序列进行性比对。
从图5可以看出分离获得菌株与grr r、rr 、grr 和grr rz聚群但与grr r位分支。
从分子角进步确定了该病菌grr r。
6 不杀菌剂室抑菌作用由表可知稀释500倍50%多菌灵可湿性粉剂与稀释 000倍60%苯醚甲环唑水分散粒剂对病原菌抑制效佳抑制带宽高达到35 而对照菌落直径335 抑制率达到903%。
稀释800倍50%氯溴异氰尿酸对病原菌没有抑制效。
推荐浓条件下整体防效表现多菌灵（苯醚甲环唑）>木霉菌>甲基硫菌灵>苯甲嘧菌酯>甲霜福美双>苯甲·丙环唑>代森锰锌>噁霉灵>三唑酮>氯溴异氰尿酸多菌灵、苯醚甲环唑、木霉菌、甲基硫菌灵、苯甲嘧菌酯、甲霜福美双和苯甲·丙环唑对病原菌抑制率超60%。
3 结与讨论英山黄花菜是湖北省英山县地方特色品种雷店镇友谊村是英山黄花菜生产基地。
由黄花菜是多年生草植物连续种植使雷店镇黄花菜叶部病害发病逐年加重引起了当地政府和农民高重视但由缺乏该病害诊断特征因对该病害防治无据可依。
英山黄花菜叶部病害由grr r引起基病症将该病害命名黄花菜叶枯病。
美国和日有Kbll r引起萱草叶枯病严重发生报道[60]国林工作者也林绿化基地发现K r引起萱草叶枯病报道[]。
研究 r是引起黄花菜叶枯病种新致病菌该病菌曾引起印茶树叶枯病[]。
英山黄花菜叶枯病病菌 ～能生长该病害发生与土壤环境不相关因雷店各田块都有该病害发生。
病菌致死温55 ℃这与英山县雷店镇黄花菜3月旬开始出土即可受到病害威胁黄花菜整生长季节该病害都严重发生直接相关。
病菌不成分培养基上虽然可生长但氮甘氨酸或者硫酸铵菌丝生长显著被抑制。
药效试验结表明病原菌对多菌灵、苯醚甲环唑、木霉菌、甲基硫菌灵敏感。
上述研究結将英山黄花菜叶枯病病害发生规律及病害防治提供理论依据。
参考献[] 吴松海郑祯赖正锋等闽南地区黄花菜生产概况及高产栽培技术[]福建农业科技0（）333[] 方达植物病理研究方法[]北京国农业出版社979[3] 刘少华陆金萍朱瑞良等种快速简便植物病原真菌基因组提取方法[]植物病理学报00535（）36365[] GR BR rr r bl rrz r[]l l993（）38[5] 贾晓辉傅俊周如军等草莓褐色轮斑病病原生物学研究及防治药剂筛选[]安徽农业科学00533（0）89850[6] R lrk rll []l Rrr968575753[7] R rb ll gr[] lg977577[8] LB G ll lrk L[]l Rrr97660333[9] L R b ll[] Vrg Grr lr993[0] K K L blg ll b rb r（Bbák） B k[]l lgl 9875360665[] 白庆荣韩 双赵 莹等萱草叶枯病菌生物学特性及对药剂敏感性研究[]艺学报030（）5359[] G KR r rr grr l blg b grr r []l 0599（3）7