复方中药丹星通络汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

【关键词】 复方丹星通络汤；脑缺血;再灌注损伤;乳酸脱氢酶；FAS。

【Abstract】 AIM: To study the neuroprotection and mechanism of danxingtongluotang （DX） on rats with focal cerebral ischemiareperfusion (I/R) injury. METHODS: Forty SD male rats were divided randomly into 4 groups: control group, shamoperated + normal saline (NS); model group, cerebral I/R+NS; nimodipine group, I/R+nimodipine; DX group, I/R+DX. The 4 groups were fed with NS, nimodipine or DX for consecutive 5 d. Focal I/R models were made with sutureocclusion method. After cerebral ischemia for 2 h and then reperfusion for 24 h, the activity of LDH in serum was measured and the expression of FAS in brain tissue was detected. RESULTS: After cerebral I/R, the activity of LDH in serum of model group increased significantly as compared with control group (P0.05); the activity of LDH in nimodipine group and DX group decreased obviously and was lower than that in model group （P0.05, P0.01）, there was no significant difference between the activity of nimodipine group and DX group (P0.05). Expression of FAS in brain tissue of model group increased significantly as compared with that in control, nimodipine and DX groups (P0.01); the expression of FAS in brain tissue of nimodipine and DX groups was decreased significantly as compared with that in model group（P0.01）; the level of DX group was lower than that of nimodipine group. CONCLUSION: DX has an obvious protection against I/R injury probably through decreasing the activity of LDH and the expression of FAS in brain tissue.

【Keywords】 danxingtongluotang; cerebral ischemia; reperfusion injury; LDH； FAS。

【摘要】 目的: 探讨复方中药丹星通络汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护作用及机制. 方法: 40只大鼠随机分为4组，即对照组(假手术+生理盐水)、模型组(缺血再灌注+生理盐水)、尼莫地平组(缺血再灌注+尼莫地平)、复方丹星通络汤组(缺血再灌注+复方丹星通络汤). 每组分别连续5 d灌胃口服生理盐水、尼莫地平、复方丹星通络汤. 线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，缺血2 h后再灌注24 h. 检测血清乳酸脱氢酶（LDH）活力、大脑FAS细胞表达. 结果:模型组大鼠局灶性脑缺血再灌注后血清LDH活力明显高于对照组（P0.05）, 尼莫地平组、复方丹星通络汤组血清中LDH活力明显降低（尼莫地平组vs 模型组，P0.01； 复方丹星通络汤组vs模型组，P0.05），尼莫地平组和复方丹星通络汤组间无显著性差异（P0.05）. 模型组大脑FAS细胞表达明显高于对照，尼莫地平，复方丹星通络汤组（P0.01）,与模型组比较，尼莫地平组、复方丹星通络汤组脑组织FAS阳性细胞数表达显著下调（P0.01）,复方丹星通络汤组明显低于尼莫地平组（P0.01）. 结论: 复方丹星通络汤可有效地防止FAS及LDH升高, 对脑缺血再灌注脑损伤有显著保护作用.

【关键词】 复方丹星通络汤；脑缺血;再灌注损伤;乳酸脱氢酶；FAS。

0引言。

复方中药丹星通络汤是在清热化痰、活血通络治疗中风病的理论基础上，化裁精简的临床经验方，由丹参、胆南星、三七等药组成. 我们观察了该药对实验性大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护作用，并初步分析了其作用机制, 为临床防治中风提供实验依据.

1材料和方法。

1.1材料复方丹星通络汤生药由大连医科大学第二附属医院中药局代购，常规水煎，浓缩至1 kg/L（生药量）的溶液备用. 尼莫地平片（山西亚宝药业有限公司）；FAS（NEO MARKERS公司），稀释度为1∶150；Sp即用型工作试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);多聚甲醛（天津市化学试剂厂）. 721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；802离心机(上海手术器械厂)；微量天平：北京赛多利仪器系统有限公司；荧光显微镜BX51：日本Olympus；数码相机cool PI995:日本Nikon；超薄切片机(上海手术器械厂)；SHZ300多用途水浴恒温箱（江苏太仓市试验设备厂）. 40 g/L多聚甲醛固定液：900 mL蒸馏水中加入Na2HPO4・12H2O 36 g，多聚甲醛40 g，加热搅拌（勿使其沸腾）,待其完全溶解后加入Na2HPO4・2H2O 3 g，定容至1000 mL；PBS：900 mL蒸馏水中加入NaCl 9 g，Na2HPO4・12H2O 6 g，Na2HPO4・2H2O 0.4 g，定容至1000 mL；DAB显色剂：临用先配. 6 mg DAB粉末加入10 mL PBS，充分研磨后，加入30 mL/L H2O 230 μL混匀，避光.

1.2方法SD大鼠体质量约200～250 g，雄性，由大连医科大学实验动物中心提供. 大鼠40只随机分为4组，即对照组、模型组、尼莫地平组及丹星通络汤组. 对照组和模型组分别灌胃生理盐水20 mL/kg，尼莫地平组20 mL/kg灌胃（浓度1 g/L），丹星通络汤组灌胃复方丹星通络汤7.5 mL/kg. 连续灌胃5 d，最后灌胃2 h后线栓法造模，用100 mL/L水合氯醛(3 mL／kg)腹腔麻醉，取仰卧位固定在手术台上行右侧大脑中动脉阻断术(MCAO)，颈部正中切开，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及翼颚动脉. 先结扎翼颚动脉的近心端，防止鱼线插入翼颚动脉，然后在颈总动脉前壁剪一小口，插入鱼线，经颈总动脉穿入颈内动脉，继续向前推进直到感觉有轻微阻力，提示尼龙线的头部已经达到了颈内动脉的分叉处,即大脑中动脉的起始部. 颈总动脉分叉处切口，插入直径0.22 mm鱼线，进入颈内动脉入颅，深度为17～20 cm，至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有的血流来源. 扎紧备线，外留1 cm长线头，缝合皮肤. 缺血2 h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至阻力时提示鱼线头端已至颈总动脉切口处，血液再通，再灌注24 h. 再灌前参照Longa等方法进行5 分制神经功能评分(0分:无明显神经病学症状；1分:不能完全伸展左前肢；2分:向左侧旋转；3分:向左侧倾倒；4分:不能自行行走). 评分为1～3分者模型制备成功，余者剔除. 不足预定数额者按照随机抽样原则补齐动物并重新造模. 对照组栓线不插入颈内动脉颅内段， 其余同以上.

血清中LDH活力的测定：脑缺血、再灌注模型再灌24 h，腹主动脉取血5 mL，高速离心机离心取上清液2 mL，编号,2～4℃冷藏，制备血清标本；将备好的血清用分光光度剂测定测定管A值、测空管A值、标空管A值、标准管A值，利用公式，计算血清中LDH活力. 血清中LDH活力=（测定管A值—测空管A值）/（标准管A值—标空管A值）×2000,标准管A值=0.1899, 标空管A值=0.085, 测空管A值=0.12.

大鼠脑组织FAS的平均阳性细胞数分析：将各组大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，左心室插管经升主动脉快速灌注生理盐水200 mL，再持续灌注0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的40 g/L多聚甲醛固定液300 mL，断头取脑，再用相同固定液后固定1 h，制备脑组织； 石蜡包埋、切片、防脱片处理；分别取与HE染色相邻的切片进行FAS免疫组化检测：免疫组化采用SP法，DAB显色；结果评定：用光学显微镜（×400），观察每个视野中FAS蛋白表达数目（胞质棕黄色为阳性细胞），每组随机数5个视野取其均值作为本组的代表值.