总黄曲霉毒素ELISA定量检测试剂盒研制

【摘要】 目的 研究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒素的ELISA检测方法，形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂盒。方法 在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上，利用间接竞争ELISA方法，研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒，并对试剂盒的各项技术参数进行测定。结果 该试剂盒对黄曲霉毒素B+G标准品的最低检出浓度为026ng／ml，标准曲线的线性范围为026～2000ng／ml，线性方程y=—04463x+03532(R2=09915)；对黄曲霉毒素B+G50％的抑制浓度为208ng／ml；试剂盒的条内变异系数为418％，条间变异系数为521％，抗体亲和力常数为152×10—10mol／L；对玉米3个加标水平的平均回收率分别为9863％，9456％和11205%；对花生的3个加标水平的平均回收率分别为8866%，8750％和8560％。试剂盒37℃可放置96h以上；试剂盒对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率分别为100％，575％，104％和19％，与其他真菌毒素无交叉反应。结论 研制出的ELIS试剂盒能定量检测食品中总黄曲霉毒素。

【关键词】 总黄曲霉毒素。

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是黄曲霉（XspeEillusflavus)和寄生曲霉(Aparasiticus)等产生的一组结构类似的次生代谢产物。据Gabal等〔1〕报道，有40％的黄曲霉菌株培养物可同时测出黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）。同时黄曲霉毒素的毒性具有协同作用，因此，90％以上的国家都制定了食品中总黄曲霉毒素的限量标准。目前总黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、色谱法。我国执行的食品中总黄曲霉毒素B1+B2+G１+G2的国家标准测定方法是薄层色谱法和微柱筛选法，均为目测半定量法，最低检出浓度为5μg/kg〔2〕。这些方法因受本身的限制，精确度低、敏感性差；样品前处理过程复杂费时；或需要价格昂贵的仪器，检测成本高，难以推广应用，影响了粮油食品中黄曲霉毒素的有效监测。酶联免疫吸附法(ELISA)是在免疫学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术，特别适合于对黄曲霉毒素污染监控中大量样本的筛检。本研究以B细胞杂交瘤技术以能分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，建立了检测玉米、花生中总黄曲霉毒素的ELISA检测方法，并初步研制出具有我国自主知识产权的ELISA试剂盒。

1 材料与方法。

11 材料。

111 主要仪器 CO2培养箱(美国Queue公司)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)；生物倒置显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；酶标分析仪(瑞士SUNRIS公司）；电子分析天平(瑞士Mettler公司)；低温高速离心机(德国Hermle公司)；电泳仪(美国BIO—RAD公司）等。

112 试剂 AFB1—BSA、黄曲霍毒素(B+G)(Aflatoxin B+G)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1）黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2，AFB2)、黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)、黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2，AFG2)、T—2毒素(T—2toxin)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、展青霉素(Patulin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivslenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、匙孔嘁血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、伏马菌素B1、抗体亚类测定试剂盒(IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)（美国Sigma公司）；RPMI1640培养基、选择性培养基、福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)、吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW5000)、青霉素，链霉素(美围Gibco公司）；辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山试剂公司)；30％H2O2(优级纯，北京化工厂)。

113 溶液系统ELISA使用液 参考文献［3］制备。

114 细胞系与实验动物 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2／0由本室传代，并经8一氮杂鸟嘌呤处理。雌性BALB／c小鼠，体重18～20g(军事医学科学院实验动物研究所动物繁育场)。

115 抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞株 本研究室自制。

12 方法。

121 单克隆抗体生产 将抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，获得含抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的腹水，并将所得腹水采用饱和硫酸铵盐析法进行纯化〔4〕。

122 抗体特性鉴定 抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类鉴定试剂盒；抗体的纯度及分子量用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)测定；IgG含量采用二喹呆甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒进行测定；抗体滴度测定采用间接非竞争ELISA方法：以AFB1—BSA为包被抗原，从1：10000倍开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2／0细胞培养上清为阴性对照，以(A试验—A空白)／（A对照—A空白）≥21的最大稀释倍数为滴定终点；抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉素A(OA)、伏马菌素B1、T—2毒素和载体蛋白BSA。

13 试剂盒各项技术参数研究。

131 方法的检出限(灵敏度) 用间接非竞争ELISA法作抗体滴度测定，找出合适的抗体工作浓度。再用间接竞争ELISA法作棋盘滴定，找出合适的包被浓度与毒素的竞争浓度，最后作标准曲线，确定线性范围及检出限。

132 方法的回收率试验 根据试剂盒的检测范围确定加标浓度，在不含黄曲霉毒素的玉米和花生样品中分别进行高、低2个浓度的加标回收试验，每个加标水平做5个重复的平行样。样品的提取方法为：样品粉碎后使其90％通过250～500μm网筛。称取5g加到100ml具塞三角烧瓶中，加入05g NaCl及25ml甲醇水溶液(70：30，v／v)，剧烈震荡30min后过滤。滤液用纯水稀释10倍进行检测。样品中黄曲霉毒素浓度(μg／Kg)=CDX／W。式中：C—酶标板上测的黄曲霉毒素浓度(ng／ml)，根据标准曲线求得；D—样品提取液的体积(ml)；X—稀释倍数；W—样品重量(g)。

132 试剂盒稳定性试验 对试剂盒稳定性采用37℃加速破坏实验进行研究，将试剂盒分别放置于4℃和37℃，每隔24h进行ELISA测定，测定阴性对照(不加毒素B0)和阳性(即50％的抑制毒素浓度B)的吸光度(A)值，计算两者的比值(B／B0)。当B006个吸光度(A)值，或B／B0。