己酮可可碱对精子运动能力和受精能力的影响
良好的精液质量及精子活力是成功受精的重要保障。在男性因素不育的患者中,精子功能障碍是重要的原因之一,如少精子症、弱精子症、精子顶体反应缺陷等,这样的夫妇不能正常受精,只能采取辅助生殖技术进行治疗。辅助生殖技术在男性不育治疗中的应用,促进了体外提高精子运动和受精能力的研究。许多物质像血清、腹腔液、卵泡液和其他的化学修饰药物如孕酮、腺苷类似物和甲基黄嘌呤等都被用来提高人精子的运动和受精能力。 甲基黄嘌呤的衍生物如咖啡因、己酮可可碱(pentoxifylline,PF)是近年研究较多的一类精子功能促进物。甲基黄嘌呤是磷酸二酯酶的抑制剂,通过抑制磷酸二酯酶的活性,减少cAMP的分解,从而提高精子内cAMP的浓度[1]。在某些假说中cAMP被认为参与了精子超激活运动(hyperactivated motility,HAM)和精子顶体反应(acrosome reaction,AR)的信号转导[2]。在上述作用中,PF与咖啡因相比,其作用持续时间更长,水溶性更高,因此更受重视。PF在临床上已被用于治疗心血管疾病,在辅助生殖中也被用来治疗男性因素不育。关于PF对精子功能影响的研究报道较多,笔者就该方面的进展作一概述。
1 PF与精子活动力 关于PF对精子运动作用，多数报道认为,PF可以提高精子的许多运动参数。例如Yunes等发现用PF处理精子可以提高精子的运动速率,而且精子尾部蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显提高,他们认为精子尾部蛋白酪氨酸的磷酸化是PF抑制磷酸二酯酶活性来增强精子运动的根本原因[3]。Mariappa等的实验也表明,精子尾部鞭毛蛋白的酪氨酸磷酸化是调节精子鞭毛弯曲从而调整精子运动的关键因素[4]。其他研究也表明,PF可以提高精子的曲线速度和精子头侧摆幅度[56],但Nassar等对PF能提高精子运动的鞭打频率、直线速度和平均路径速度提出了质疑:体外用3.6 mmol/L PF孵育精子30 min并不显著增加正常精子或弱精子的鞭打频率、直线速度和平均路径速度[6]。尽管这样,还是表明了PF能够提高人精子的运动能力。 PF除了可以提高正常男性精子的活动力,也可以提高弱精子症患者精子的活动力和活动率[78]。此外PF也可以提高癌症患者和脊髓损伤病人精子的运动参数和活动率[910]。这些结果表明,PF可以提高活动精子和前向运动精子的数量并提高精子的运动质量。Terriou等研究PF对附睾和睾丸精子的作用,发现PF可以使这些部位中原本不会运动的精子获得运动能力,并且最终能正常受精[11]。这似乎提示,PF不但具有提高精子运动能力的效果,而且还有启动精子运动机制的作用。 人类精液冷冻技术虽是一个较成熟的技术,但冻融过程降低了精子的代谢,影响了细胞膜的通透性和细胞超微结构,使精子的活动率、活力和受精率明显下降。PF可以提高冻融精子的活动率和其他运动参数,延长冻融精子活力的持续时间[12]。这些研究显示了PF作为冻融精液精子运动增强剂的价值。 尽管大量的研究表明PF可以提高精子的许多运动参数,然而精子体外运动能力的提高并不一定意味着在体内也能更容易穿透宫颈黏液和卵细胞外周的透明带,因为精子在雌性生殖道中的穿行和穿越透明带不只是物理作用,其中有很多分子参与到这一过程。而精子在雌性生殖道中的穿行能力和穿越透明带的能力对受精结果起着十分重要的影响。关于PF对精子穿透宫颈黏液作用的研究还很少,已有的研究表明,PF并不能提高正常精子穿透宫颈黏液的能力[6]。
2 PF与精子获能和顶体反应 金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法可显示精子获能和顶体反应阶段的表面差异,可以客观定量的评价精子的获能和顶体反应状况。它将精子分为3种染色类型,即F、B和AR型。F型为未获能精子,其顶体帽完整,整个顶体布满黄绿色荧光;B型为已获能但未发生顶体反应的精子,其特点是顶体依然存在,但在顶体后区出现一条无或暗淡的荧光区带;AR型为完成顶体反应的精子,其顶体帽缺失,整个精子头部荧光强度降低甚或无荧光。PF能够促进精子获能。Kay等用3.6 mmol/L PF作用新鲜人精子30 min发现B型荧光精子显著增加[13]。Seshagiri等对地鼠精子的研究也得到了类似的结果[14]。 对于PF是否能够诱导精子发生顶体反应还有争议。例如Kay等的报告指出AR型精子没有显著增加[13],这提示该浓度的PF只促进精子获能而不引起AR。然而也有报道PF能直接促进精子的AR。Nassar等用豌豆凝集素标记的异硫氰酸荧光素作为荧光探针评价AR,发现PF显著地增加AR精子的数量,在孵育4 h后PF仍然可以提高AR精子的百分率。作者认为,PF能够造成AR精子增多的原因是多方面的,首先,PF可促进精子获能,获能精子增多引起发生顶体反应的精子也相应增多;其次,因为cAMP作为第二信使参与诱导精子顶体反应,PF对磷酸二酯酶的抑制提高了细胞内的cAMP水平,所以诱导精子发生AR[15]。
这些实验差别可能是由多种因素造成的。精子制备方法、精液质量差异、培养基成分、PF处理前是否经过体外获能培养、PF作用时间和浓度、评价精子顶体反应的方法等都可能造成实验结果的差异。 除了PF对精子的单独作用外,也有很多学者发现PF增加精子对AR促进物的敏感性,协同促进精子发生AR。例如,Esteves等在冷冻前用PF处理健康男性精液标本提高了精子由Ca2+介导的发生AR的能力[16]。
3 PF与精子超激活运动 精子在获能时能发生更加激烈的运动,主要特点是头部侧摆幅度和频率明显增加,尾部产生强烈鞭打样运动。这种运动方式被认为更有利于精子在黏稠的输卵管液中穿行,并被称为HAM。大量的研究表明PF可以增加正常精子标本或弱精子标本HAM精子的数量[6,17],这可以用Yanagimachi的HAM假说来解释,即PF使细胞内的cAMP水平升高,从而激发cAMP蛋白激酶的级联反应,进一步使轴丝蛋白磷酸化[18]。Hunter等也指出PF对精子运动和HAM的促进作用与其提高细胞内cAMP含量的作用有关[19]。
4 PF与受精 对于成功的受精来说,精子与透明带结合是关键环节。Yogev等用半透明带试验评价PF对精子结合透明带能力的影响,发现PF可以提高人精子结合透明带的能力,但这种作用只对特定的人群有效,并不能通过检查精子的基本参数来预测PF的作用是否有效。他还发现,PF对单个样本的作用有很大的差异性,有的增强结合能力,有的减弱结合能力,有的不起作用[2021]。因此在辅助生殖的精液准备中为了避免PF对精子的不确定和有害的影响,最好在使用PF前用半透明带试验监测其效果。 自1976年精子穿透试验(sperm penetration assay,SPA),即人精子与去透明带的金黄地鼠卵体外穿透试验建立以来,SPA渐被用于男性不育的诊断及评价治疗后精子的功能。Burger等实验证明用PF孵育正常和不育男性的精子都不能提高他们在SPA中的穿透能力[22]。 关于PF对人精子体外受精的影响还存在争议。有人认为PF提高人精子体外受精的受精率。Rizk等研究PF对49例男性因素不育和先前体外受精失败的夫妇体外受精的影响,发现PF处理的精子与卵子的受精率(56.3%)显著高于对照组(30.7%),他们认为,对于男性因素不育和体外受精失败的夫妇,PF可以提高受精率[23]。也有研究表明单独使用PF或和2脱氧腺苷联合使用可以提高先前体外受精率很低的病人的受精率[24]。 然而Devroey等的研究表明,无选择地单独使用3.6 mmol/L PF或/和3.0 mmol/L 2脱氧腺苷联合使用并不能提高原先受精率很低的夫妇的体外受精率[25]。关于PF对弱精子作用的研究表明,尽管PF可以提高前向运动精子百分率,但并不提高体外受精率;对于存在抗精子抗体的病人,PF也不能提高其体外受精的成功率[26]。 不育或体外受精率偏低只是表观的结果,其男性因素的原因很多,比如弱精子症、AR缺陷和存在抗精子抗体等,而且AR信号通路上的任何一种分子异常都可能造成AR缺陷,精子抗体也有很多种。因此这种病因上的复杂性所引起的对PF的不同反应性也就不难理解了。只有彻底了解PF作用精子的分子机理并对引起不育或体外受精率偏低的病因进行分类,才能在临床上有针对性地用PF治疗病人。
5 PF的临床应用 大多数研究都证明PF对精子多方面的作用,如提高精子的运动能力、诱导精子超激活运动、促进精子获能、增加精子对AR促进物的敏感性、提高精子结合透明带的能力等。这些特点提示在辅助生殖的精液准备中可以添加PF,用于临床治疗不育症。Negri等对由于男性因素不育进行的101例的宫内人工授精中发现,添加PF的精液的妊娠率显著高于对照组[27]。Griveau等用来自无精子症患者睾丸的冻融精子进行精子卵浆内注射,发现PF处理组的受精率明显高于对照组,应用PF选择有活力的冻溶睾丸精子进行精子卵浆内注射的妊娠率与用新鲜的射出精液进行受精的妊娠率没有差别[28]。 虽然这些研究表明了PF在临床应用中的价值,但是将PF广泛应用于临床还面临很多问题,例如由于不同精液样本对PF反应的异质性,PF作用的时间和浓度很难标准化,PF处理精子后对胚胎的毒害作用等[29]。因此只有进一步了解PF对精子作用的分子机制,并对男性不育或体外受精率偏低的病因进行分类,才能在临床上有针对性地用PF治疗病人。