环孢菌素A、雷洛昔芬及其联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药的研究
; 作者：鲍文,陈宝安,高峰,丁家华,许文林1,沈惠玲1,高冲,孙耘玉,程坚,王骏,赵刚,马燕。
毕业论文。
【摘要】; 本研究探讨环孢菌素A（CsA）、雌激素受体抑制剂雷洛昔芬及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。采用甲基四唑蓝法(MTT)测定柔红霉素(DNR)的半数抑制量，RT—PCR法检测mdr1基因mRNA表达水平，FCM检测P—gp的表达和细胞内DNR浓度。结果表明： DNR对K562/A02和K562细胞的IC50分别为23.51和0.29mg/L，雷洛昔芬(2.5 mg/L)及CsA( 1 mg/L)单用和两药联合处理K562/A02细胞时， DNR的IC50值分别为5.98、8.15和3.68 mg/L，两药对DNR作用K562细胞的IC50没有影响。CsA及雷洛昔芬单独作用后耐药株mdr1 mRNA下调微弱，联合用药下调效果明显。CsA及雷洛昔芬均可降低P—gp蛋白的表达，且具有协同作用。同时还观察到逆转剂雷洛昔芬和CsA作用后细胞内柔红霉素浓度增加，两药联合作用时效果增强。结论： CsA及雷洛昔芬均可逆转耐药,且联合作用效果增强。 毕业论文。
【关键词】; 环孢菌素A; 雌激素受体抑制剂; 雷洛昔芬； K562/A02细胞; 多药耐药 毕业论文。
Effect of Cyclosporine A, Raloxifene and Their Combination on the Reversion of Multidrug Resistace of K562/A02 Line 毕业论文。
AbstractThis; study was aimed to investigate the reversible effect of cyclosporine A, raloxifene and their combination; on multidrug resistance cell line K562/A02. The IC50 (the concentration causing 50% inhibition of cell growth) of DNR were assayed by MTT method, the expression level of mdr—1 mRNA was assayed by RT—PCR, p—glycoprotein (P—gp) expression and intracellular DNR concentration were detected by flow cytometry. The results showed that ; the IC50 of DNR on K562/A02 and K562 cells were 23.51 mg/L and 0.29 mg/L,; respectively.; The; IC50 of DNR on K562/A02 cells in treatment with; raloxifene CsA and both combination; were; 5.98,8.15 and 3.68 mg/L respectively, but both drugs not influenced IC50; of DNR on K562 cells. Pretreating K562/A02 cells with raloxifene (2.5 mg/L) or CsA (1 mg/L); for 48 hours partially restored the sensitivity of K562/A02 cells to DNR. ; Cyclosporine A and raloxifene (alone or combination) elevated the intracellular DNR concentration; in K562/A02,; down regulated; P—gp and mdr—1 mRNA; expressions. It is concluded that; multidrug resistance (MDR) can be partially reversed by CsA; or raloxifene, the combination of both drugs shows a great synergistic reversal effect. 毕业论文。
Key wordscyclosporine A; estrogen—receptor inhibitor raloxifene K562/A02 drug resistance 毕业论文。
多药耐药(multidrug resistance, MDR)系多因素所致,肿瘤细胞mdr1基因过度表达导致细胞膜上相对分子质量170×103的糖蛋白(P—glycoprotein, P—gp)增多是产生MDR的主要机制,P—gp具有药物"泵"的功能,能将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外以减少细胞内药物蓄积,从而使肿瘤细胞发生MDR ［1］。肿瘤化疗失败的主要原因之一是多药耐药性的产生，因此如何成功地逆转多药耐药是当前肿瘤治疗学中的一个研究热点。已有文献报道，屈洛昔芬不能明显增强化疗药物柔红霉素（DNR）对K562敏感细胞的杀伤作用,但能明显增强DNR对K562/A02耐药细胞的杀伤作用［2］。国外有文献报道,单独应用环孢菌素Ａ(CsA)或雷洛昔芬在体外实验中获得了一定的逆转效果,我们以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为实验研究对象进行体外实验。 毕业论文。
材料和方法 毕业论文。
K562/A02细胞是经阿霉素逐步诱导、具有MDR表型的稳定细胞系,由中国医学科学院血液学研究所提供,实验前无药培养2周。K562敏感株由中国科学院上海细胞生物研究所提供。细胞培养液由RPMI 1640培养液(Gibco BRL)、10%小牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml组成。K562细胞置于37℃、5% CO2培养箱中,2—3天传代1次。 毕业论文。
药物及试剂 毕业论文。
柔红霉素(DNR)为意大利Farmitalia公司产品，环孢菌素A（CsA）为瑞士山德士公司产品，雷洛昔芬（由江苏省药物所提供），四甲基偶氮唑盐(MTT)为Fluka公司产品,用PBS配制成5 g/L。 PCR引物mdr1(436 bp)(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)F: 5′—TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG—3′,; R: 5′—AGATCAGCAGGAAAGCAGCACCTA; —3′; β—action(内参照)(270 bp) F: 5′—CTACAATGAGC; TGCGTGTGGC —3′,; R:5′—CAGGTCCAGACGCAGGATGGC; —3′。 毕业论文。
取对数生长期细胞, 加入逆转剂（单用或联合，CsA终浓度1 mg/L,雷洛昔芬终浓度2.5 mg/L）作用1小时,按所设梯度加入不同浓度DNR,每个浓度设3个复孔。另设不加逆转剂、不加DNR、不加细胞的对照组，接种于96孔板,每孔含2×105个细胞悬液200 μl。置于37℃、5% CO2培养箱孵育48小时后取出,加MTT反应液20 μl，继续培养4小时后,于平板离心机上2 500×g离心10分钟,弃上清,每孔加150 μl二甲亚砜溶解,微量振荡器混匀,酶标仪上测定540 nm波长的吸光度(A)。计算细胞的生长抑制率：生长抑制率(%)=(1—试验孔A/对照孔A)×100%根据生长抑制率采用综合法计算半数抑制量(IC50)。逆转倍数=耐药株IC50/加逆转剂后IC50实验重复5次,每次设3个复孔,取平均值为最终结果。 毕业论文。
mdr1基因mRNA表达水平的RT—PCR测定 毕业论文。
取K562/A02细胞(终浓度2×105/ml,每组4 ml),分组加药；分别于37℃、5% CO2培养箱中,孵育48小时收集细胞。细胞内总RNA的提取:取干预好的各实验组细胞,离心弃上清后,直接于离心管中加入1 ml TRIZOL试剂 (Molecular Reseach Center公司产品)提取总RNA。 RT—PCR: cDNA合成所需逆转录酶及体系均为TaKaRa LA PCR TM Kit Ver.2.1试剂盒(大连宝生物工程有限公司产品)，PCR仪为Gene Amp PCR System 2400(Applied Biosystems)。按试剂盒说明书进行操作,细胞总RNA反应量均为2 μg，总反应体积为25 μl。 毕业论文。
反应条件为①逆转录反应: 30℃ 10分钟,42℃ 30分钟,99℃ 5分钟,5℃ 5分钟; ②PCR反应: 94℃ 2分钟,预变性; 94℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,30个循环。PCR产物于4℃下短期保存。 毕业论文。
PCR产物的检测和分析选取5 μl; PCR产物，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳50分钟,溴化乙锭染色，紫外灯下照相,用ImageMaster VDS图像分析处理系统扫描。图像输入计算机,用ImageMaster Total Lab分析软件进行灰度分析,并以β—action校正作相对量分析,数值以两者之积分吸光度的比值表示。 毕业论文。
P—gp表达的FCM检测 毕业论文。
取K562/A02细胞株,终浓度2×105/ml，分组加药，分别孵育48小时、收集细胞。冷PBS液洗3次, 2 500×g离心5分钟,弃上清,加入P—gp单克隆抗体5 μl(标有荧光素PE)。避光,常温保存20分钟后,加生理盐水洗1次, 2 500×g离心5分钟,弃上清,加0.5 ml生理盐水,上流式细胞仪（FACS Calibur 美国Becton Dickinson公司产品）检测。 毕业论文。
毕业论文。
取K562/A02细胞株，终浓度2×105/ml，分组加药，分别孵育48小时，另设K562细胞及不加逆转剂K562/A02细胞对照组(细胞终浓度2×105/ml)，分别加入DNR(浓度：; 1 mg/L)，置于37℃、5% CO2培养箱孵育2小时，冷PBS液洗3次, 2 500×g离心5分钟,弃上清用流式细胞仪测定细胞内DNR浓度。 毕业论文。
统计学处理 毕业论文。
分组实验比较采用t检验。用SPSS 11.0统计软件进行分析。 毕业论文。
结果 毕业论文。
逆转剂处理前后DNR对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用 毕业论文。
DNR对K562/A02细胞和K562细胞的IC50分别为23?51 mg/L和0.29 mg/L,耐药倍数为81。用雷洛昔芬(2.5 mg/L)处理后, DNR对K562/A02细胞的IC50为 5.98 mg/L，逆转倍数为 3.93。CsA( 1 mg/L)处理K562/A02细胞后DNR IC50为8.15 mg/L，逆转倍数为2?88。两药联合对DNR作用K562/A02细胞的IC50值为3.68 mg/L，逆转倍数为6.39。逆转剂对K562/A02细胞的DNR毒性有明显影响(P0.01)(表1)。雷洛昔芬（2.5 mg/L）处理后DNR对K562细胞的IC50值为0.32 mg/L。CsA(1 mg/L)处理后DNR对K562细胞的IC50为0.31 mg/L。两药联合对DNR作用K562细胞的IC50值为0?28; mg/L。逆转剂对DNR作用K562细胞的DNR毒性无明显影响(P0.10)(表2)。Table 1.; Inhibition rate; of DNR on proliferation of; K562/A02; cells treated with DNR, CsA and raloxifene for 48 hours （略) 毕业论文。