胰岛素强化治疗对高血糖烫伤和创伤大鼠肝核转录因子κB的影响
作者：张胜兰，张晓雷，寇伟，耿明，刘鹏。
【摘要】 目的 探讨胰岛素强化治疗对高血糖烫伤和创伤大鼠肝脏核转录因子κB（NF—κB）表达的影响。方法 60只Wistar雄性大鼠用链脲佐菌素腹腔注射诱发DM模型，随机分为烫伤强化治疗组（n=15）和烫伤常规治疗组（n=15）,创伤强化治疗组（n=15）和创伤常规治疗组（n=15）。强化治疗组将血糖控制在3.9～5.6mmol/L，常规治疗组将血糖控制在10～12mmol/L。于治疗后第10天活杀取肝右叶部分，4%多聚甲醛固定，切片，免疫组化观察NF—κB的表达。 结果 烫伤和创伤强化治疗组NF—κB表达显著低于烫伤和创伤常规治疗组（P0.05）。 结论 胰岛素强化治疗组NF—κB表达显著低于常规治疗组，显示胰岛素强化治疗与常规血糖控制相比能更好地抑制炎症反应，发挥机体保护作用。
【关键词】 高血糖大鼠；胰岛素强化治疗；烫伤和创伤；核转录因子κB；肝脏。
【Abstract】 Objective To investigate the effect of insulin intensive threapy on NF—κB expression in the livers of hyperglycemic scald and trauma rats . Methods 60 male Wistar rats were received intraperitoneal injection of streptozotocin to establish diabetic model. Then they were randomized into 4 groups:scald intensive therapy group(n=15) and scald conventional therapy group(n=15). trauma intensive therapy group(n=15) and trauma conventional therapy group(n=15). Blood glucose was maitained at the level of 3.9～5.6mmol/L in the intensive therapy group ,and 10～12mmol/L in the conventional therapy group. At the 10th day after therapy ,the livers were collected, then the expression of NF—κB was observed by immunohistochmistry.Results The expression of NF—κB in scald and trauma intensive therapy group was significantly lower than that in the conventional therapy group(P0.05).Conclusion The expression of NF—κB in scald and trauma intensive therapy group was significantly lower than that in the conventional therapy group, which suggest that insulin intensive therapy can inhibit inflammatory response better than conventional therapy, and exert protection to the body.
【Key words】 hyperglycemic rats;insulin intensive therapy; scald and trauma; nuclear transcription factor—κB; liver。
近年的研究已证明，糖尿病患者发生危重症的频率和需要手术干预的机会都比非糖尿病患者要多［1］，而国外在糖尿病危重症的抢救中［1，2］，胰岛素强化治疗较常规治疗可提高其抢救成功率和降低死亡率的优势已见报道。NF—κB是近年来发现的核转录因子，其转录调节的连接点位于许多促炎细胞因子与免疫调节的启动区，对诱导重症疾病的炎症反应起着重要作用。国内罗氏等［3］发现，创伤可明显增强脾细胞NF—κB的DNA结合活性和p65蛋白亚型的表达，在创伤后淋巴细胞活化及全身炎症反应综合征（SIRS）的发生、发展过程中可能起重要作用。为探讨在糖尿病危重症中胰岛素强化治疗对肝脏NF—κB的影响特做以下实验研究。
1 材料与方法。
1.1 模型制备 Wistar雄性大鼠60只，购自山东大学实验动物中心，鼠龄8～12周，体重220～240g，清洁级饲养，大鼠禁食12h后按55mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素（购自Sigma公司），3天后测尾静脉血糖13.9mmol/L为糖尿病成功模型，再把糖尿病大鼠制成烫伤或创伤模型。烫伤模型制备：盐酸氯胺酮（30mg/kg）麻醉，背部90℃下烫伤10s，造成30%总体表面积（TBSA）深Ⅱ度烫伤，伤后即刻腹腔注射5ml生理盐水抗休克，将成模大鼠随机分成A、B两组，A组为烫伤强化治疗组（n=15），B组为烫伤常规治疗组（n=15）。创伤模型制备：清醒状态下双后肢钳断，造成双后肢股骨中部闭合性骨折伴周围软组织挫伤模型，然后将成模大鼠随机C、D两组，C组为创伤强化治疗组（n=15），D组为创伤常规治疗组（n=15）。4组大鼠均每日4次喂食，饮水不限，每日2次腹腔注射庆大霉素注射液0.8万u防治感染。胰岛素强化治疗均采用每日4次皮下注射的方法，即早、中、晚喂食前注射普通胰岛素，21：30注射中效胰岛素。A组与C组使血糖控制在3.9～5.6mmol/L，B组与D组使血糖控制在10～12mmol/L，血糖检测采用美国强生稳豪血糖仪检测尾静脉血糖。4组大鼠均在烫伤或创伤后治疗喂养10天。
1.2 标本收集和免疫组化方法。
1.2.1 标本的收集 4组均在烫伤或创伤后治疗喂养10天后活杀存活大鼠，取肝右叶部分，放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48h。
1.2.2 免疫组化方法 免疫组化采用链霉卵白素法（SP法），抗NF—κB p65单抗、SP免疫组化试剂盒及二甲基联苯胺（DAB）试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。各组织切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后置于枸橼酸钾缓冲液中微波加热至92～98℃15min以修复抗原，自然冷却至室温后依次按试剂盒说明完成免疫染色各步骤。
1.3 免疫组化结果判断［4］ 阳性细胞百分比记分：按视野内阳性细胞所占总细胞数的比例记分，0、25%、26%～50%、51%～75%、75%分别记分为0、1、2、3、4分。着色强度记分：按阳性细胞着色(颜色)无、弱（淡黄）、中（棕黄）、强（棕褐）分别记分为0、1、2、3分。结果判定：上述两种记分结果相加，0分为阴性（－）；2～3分为弱阳性（+）；4～5分为中等阳性（++）；6～7分为强阳性（+++）。本实验中每张切片随机取3个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比记分与着色强度记分，3个视野记分的平均值为该切片的最后得分。
1.4 统计学分析 等级资料的两样本间比较Mann—Whitney U检验，借助SPSS11.5软件完成。检验水准α=0.05。
2 结果。
A组（烫伤强化治疗组免疫组）化染色（图1）：高倍镜视野内可见少量肝细胞胞浆淡黄色颗粒状物质，胞核内亦可见少量淡黄色颗粒状物质。B组（烫伤常规治疗组免疫组）化染色（图2）：高倍镜视野内大多数肝细胞胞浆均可见棕褐色颗粒状物质，胞核内亦可见大量棕褐色颗粒，胞浆和胞核内棕褐色颗粒状物质较烫伤强化治疗组明显增多。
烫伤强化治疗组NF—κB表达显著低于烫伤常规治疗组（P0.05，表1）。
C组（创伤强化治疗组）免疫组化染色（图3）：少量肝细胞胞浆内可见淡黄色颗粒状物质，胞核内亦可见少量淡黄色颗粒状物质。D组（创伤常规治疗组免疫组）化染色（图4）：视野内大多数肝细胞胞浆内均可见棕褐色颗粒状物质，胞核内亦见较多棕褐色颗粒，胞浆和胞核内棕褐色颗粒状物质较创伤强化治疗组明显增多。
创伤强化治疗组NF—κB表达显著低于创伤常规治疗组（P0.05，见表1）。 表1 4组间肝脏NF—κB免疫组化染色结果的比较注：强化治疗组与常规治疗组比较，*P0.05 （Intensive therapy group vs cnventional therapy group,*P0.05）。