五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响
作者：黄晓敏， 简润好， 余晓铃， 曾穗红， 简笑欢， 黄伟雄， 吴中兴。
【摘要】 目的研究五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响。方法采用试管对倍稀释法测定五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的最小抑菌浓度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＭＩＣ）。采用平板改良体外复制假单胞铜绿杆菌生物膜模型，并检测五倍子醇提液的不同ＭＩＣ 浓度对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响作用。结果五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的ＭＩＣ 为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ，１．５ 倍的ＭＩＣ（４６．８ ｍｇ／ｍｌ）能使生物膜活菌数明显减少，但不能完全清除生物膜上的细菌，２ 倍的ＭＩＣ（６２．５ ｍｇ／ｍｌ）对细菌生物膜有完全清除作用。结论五倍子对铜绿假单胞菌生物膜有清除效应，但还需要进行临床用药研究。
Abstract：ObjectiveＴｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ.cｈｉｎｅｎｓｉｓ ｏｎ P．aeruginosa Ｂｉｏｆｉｌｍ ．MethodsＭｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＭＩＣ） ｗas ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌe ｄｉｌｕｔｉｏｎ， ａｎｄ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ was induced ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｒｏｗｎｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＭＩＣ ｏｎ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ．ResultsＴｈｅ ＭＩＣ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｔｏ Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｗａｓ ３１．２５ｍｇ／ｍｌ， １．５ＭＩＣ（４６．８ｍｇ／ｍｌ） ｏｆ Ｇａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ coulde ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ， ａｎｄ ２ＭＩＣ （６２．５ ｍｇ／ｍｌ） had ｔｈｅ eliminating effect ｏｎ ｉｔ．ConclusionＧａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｈａｓ ｔｈｅ eliminating effect ｏｎ P．aeruginosa Ｂｉｏｆｉｌｍ， ｗｈｉｃｈ ｓｔｉｌｌ ｎｅｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．。
Key words：Ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇａｌｌａ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ； P ．aeruginosa； Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ 五倍子（Ｇａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）为植物漆树科盐肤木Rhus chinensis Ｍｉｌｌ，青麸杨R．potaninii Ｍａｘｉｍ．或红麸杨R．punjabensis Ｓｔｅ Ｗ．ｖａｒ．sinica Ｒｅｈｄ．ｅｔ Ｗｉｌｓ．等的叶或叶柄上受倍蚜虫刺伤寄生的虫瘿，产于四川、贵州、云南等地。秋季采收，煮死虫瘿内部寄生虫，晒干，生用。五倍子明确的抑菌或杀菌作用已有较多报道［１］ ，但五倍子对细菌生物膜影响的相关报道却不多见。 细菌生物膜（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ， ＢＦ）是细菌抵抗不利环境，营造合适的微生环境，以利于生存的一种黏附定植式群体生存方式。ＢＦ 现象不仅是近年来逐渐受到重视的细菌生物学特性，而且与许多慢性难治性细菌感染及医院内感染密切相关。研究表明，假单胞铜绿杆菌是临床产生ＢＦ 相关感染最常见的条件致病菌，由于假单胞铜绿杆菌ＢＦ 的形成，抗菌药物难于渗透，导致抗生素治疗时间长，细菌易产生耐药，造成临床上某些难治性感染（如获得性肺炎及慢性呼吸道感染等） ［２］ 。目前国际和国内对假单胞铜绿杆菌的生物膜抑制作用主要致力于抗生素的研究，本实验主要探讨五倍子醇提液在体外对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响，为临床用药提供参考。
1 器材与方法。
1.1 样品来源①试验样品：五倍子为烤干生药，由广东省粤北医院中药房提供。②样品配制：以４０ ｇ 生药与２００ ｍｌ ９５％乙醇的比例配合，并采用乙醇回流提取法，加热回流提取３ 次，每次用９５％乙醇２００ ｍｌ，过滤，合并提取液，减压回收乙醇［３］ ，调整药物浓度为１００ ｍｌ 药液含生药２０ ｇ，调节ｐＨ 为７．４，０．０８ ＭＰａ 的蒸气压１００℃的温度灭菌１５ ｍｉｎ 备用。
1.2 菌株来源及其试剂①黏液型铜绿假单胞菌临床分离株，来源于广东省韶关市第一人民医院检验科，经本学院微生物学实验室ＴＤＲ －２００Ｂ 全自动型微生物分析仪检测鉴定证实。②质控菌株：P．aeruginosa ＡＴＣＣ ２７８５３，来源于中国药品生物制品检定所。③菌株培养：受试菌培养采用大豆胰酶肉汤（Ｌｕｒｉａ －Ｂｅｒｔａｎｉ Ｍｅｄｉｕｍ，ＬＢ 肉汤），ＬＢ 琼脂平板，ｐＨ ７．４ 磷酸盐缓冲溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＰＢＳ）等均为本实验室配制。④实验用高分子滤膜为０．２ μｍ 孔径，由Ｇｅｌｍａｎ 公司提供。
1.3 仪器ＴＤＲ －２００Ｂ 全自动型微生物分析仪（长沙天地人生物科技有限公司），旋涡混合器（北京同正技术发展公司），７２１ 分光光度计（上海第三分析仪器厂），麦氏比浊仪（法国ｂｉｏ －Ｍｅｒｉｅｕｘ 公司），Ｏｌｙｍｐｕｓ 光学显微镜。
1.4 体外抑菌实验采用试管对倍稀释法测定五倍子醇提液对铜绿假单胞菌的ＭＩＣ 同时，平行测定其对Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２７８５３ 的ＭＩＣ，作质量控制。测定技术依据ＮＣＣＬＳ ２００４ 标准［４］ 。五倍子醇提液对铜绿假单胞菌的ＭＩＣ 为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ 。
1.5 体外ＢＦ 模型的制备按文献方法［５］ 并进行改良，将复苏后传代培养１６ ｈ 的铜绿假单胞菌接种于ＬＢ 平板中传代二次，挑取典型菌落接种至ＬＢ 肉汤３７℃培养２４ ｈ，用ＰＢＳ 调整细菌浓度为０．５ 麦氏浊度（含菌量约１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）。将高分子滤膜制成直径为７ ｍｍ 圆片，经压力蒸气灭菌后平铺在ＬＢ 平板表面；取２０ μｌ 铜绿假单胞菌菌液滴加在膜片表面，３７℃培养２４ ｈ 制成生物膜片，再将膜片转移至新的培养基中，连续转移５ 次培养７ ｄ，即可形成成熟的ＢＦ。