内皮型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病关系
摘要： 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因内含子4可变串联重复序列(VNTR)多态性与早发冠心病的关系。方法 以医院为基础的病例对照研究，选择新诊断的冠心病患者为研究对象。男性≤55岁及女性≤65岁患冠心病为早发冠心病，以188例早发冠心病患者为病例组，315例迟发冠心病患者为对照组。应用聚合酶链反应(PCR)技术检测eNOS基因内含子4 VNTR多态性。结果 eNOS基因内含子4 VNTR c/c、c/b、b/b、b/a、a/a基因型频率，早发冠心病组分别为053%，000%，8138%，1649%，160%；迟发冠心病组分别是 000%，032%，7746%，2032%，190%。c/c+c/b+b/b与b/a+a/a基因型在2组之间分布差异无统计学意义(P=0268，OR=1294，95%CI=0820～2043)。c、b、a等位基因频率，早发冠心病组分别是053%，8963%，984%；迟发冠心病组分别是016%，8778%，1206%。c+b与a的等位基因频率在2组间分布差异无统计学意义(P=0280，OR=1257，95%CI=0830～1904)。在α=005显著性水平上，用多元逐步非条件Logistic回归分析调整性别、吸烟、饮酒、收缩压、体质指数、腰臀比、甘油三酯和总胆固醇后，eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病也无显著相关(P=0427, OR=0819, 95%CI=0500～1341)。结论 eNOS基因内含子4 VNTR多态性可能不是早发冠心病发病的危险因素。
Association between polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene and coronary heart disease。
Abstract： Objective To assess the association between intron 4 VNTR polymorphism in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and premature coronary heart disease(p—CHD).Methods A hospital—based case—control study was conducted.Newly—diagnosed CHD patients were recruited as this study subjects.one hurdred and eighty—eight CHD patients diagnosed at/before 55 years old for males and 65 for females were assigned to p—CHD case group with other 315 CHD patients as the control group.Genotypes were detected by polymorphism chain reaction (PCR) technique.Results The genotype frequencies of c/c,c/b,b/b,b/a,a/a were 053%,000%,8138%,1649%,160% in p—CHD group respectively and 000%,032%,7746%,2032%,190% in the control group respectively.There was no significant difference between the p—CHD and the control group for comparing genotype frequencies of c/c+c/b+b/b with b/a+a/a (P=0268,OR =1294,95%CI=0820～2043).The allele frequencies of c,b,a were 053%,8963%,984% in the p—CHD group respectively and 016%,8778%,1206% in the control group respectively.There was also no significant difference between the p—CHD and the control group for comparing allele frequencies of c+b with a (P=0280，OR=1257，95%CI=0830～1904).Stepwise multiple logistic regression analysis at 005 significant level with adjust ment of sex,smoking,alcohol drinking,systolic blood pressure,overweight,waist—hip ratio,serum triglyceride,serum total cholesterol covariates showed that the eNOS4a had no significant effect on p—CHD (P=0427,OR=0819,95%CI=0500～1341).Conclusion eNOS intron 4 a/b VNTR polymorphism is not a risk factor for p—CHD.
Key words： coronary heart disease;nitric oxide synthase;endothelial;gene 遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病CHD)发病中具有重要作用，但早发与迟发病例在遗传背景方面存在较大差异，其中，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对冠心病具有重要作用〔1〕。eNOS基因内含子4存在27bp的可变串联重复序列(VNTR)，研究显示，这种多态性与机体一氧化氮(NO)的代谢水平密切相关〔2〕。为探讨eNOS基因内含子4VNTR多态性与早发冠心病之间的关系，本文对188例早发冠心病及315例迟发冠心病进行观察比较。结果报告如下。
1 对象与方法。
11 对象 选择2002年6月～2005年6月山东大学附属医院心内科确诊的新发病例503例，均符合1979年WHO制定的关于缺血性心脏病的诊断标准〔3〕，以男性≤55岁及女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。以早发冠心病188例为观察组，平均年龄(511±776)岁；迟发冠心病315例为对照组，平均年龄(697±802)岁。
12 方法。
121 现场调查 (1)问卷调查：内容包括年龄、性别、既往病史、吸烟史和饮酒史；体检包括身高、体重、腰围、臀围、收缩压(SBP)和舒张压(DBP)；并按体重/身高2(kg/m2)计算体质指数(BMI)，按腰围/臀围计算腰臀比(WHR)。(2)采集血样：抽取调查对象空腹肘静脉血5ml，其中1ml用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)—Na抗凝，用于基因组DNA提取；4ml分离血清，用于血清学检测。(3)血清生化指标检测：血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)用酶法测定，试剂盒由(北京中生生物工程高技术公司。)。
122 基因组DNA提取 用十二烷基硫酸钠(SDS)及蛋白酶K消化，酚/氯仿提纯，乙醇沉淀。
123 eNOS基因内含子4 VNTR多态性检测 以提取的DNA为模板，根据设计的上、下游引物，用PCR方法特异性扩增含有可变串联重复序列的片段。引物序列，上游5′—CTCAGCCCAGTAGTGAAGAC—3′；下游5′—GCTTCTCTTAGTGCTGTGGT—3′。PCR反应体系总体积为30μl，其中含模板100ng，引物各03μmol/L，50mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris—HCl (pH=84)，015mmol/L dNTPs，15U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。反应条件为95℃预变性5min，33个循环中95℃变性45s，58℃退火60s，72℃延伸45s，最后72℃延伸5min。PCR产物用8%的聚苯烯酰胺电泳，银染色观察实验结果。根据片段数量与长度进行基因型分析。
13 统计分析 用SPSS 115及STATA 82软件进行分析，计数资料用χ2检验；计量资料用两样本均数比较的t检验；多因素分析用多元逐步非条件Logistic回归。
2 结果。
21 一般情况 (1)早发冠心病组男性104例，女性84例，性别比为124∶1；迟发冠心病组男性221例，女性94例，性别比为235∶1。早发冠心病组吸烟者73例，吸烟率为388%；迟发冠心病组吸烟者92例，吸烟率为292%。早发冠心病组饮酒者44例，饮酒率为234%；迟发冠心病组饮酒者45例，饮酒率为143%。其中性别比、吸烟率、饮酒率等差异均有统计学意义(P005或P001)。(2)2组检测指标比较：早发冠心病组收缩压/舒张压分别为(12747±1810)/(7922±1100)mmHg；迟发冠心病组为(13151±2339)/(7759±1284)mmHg。早发冠心病组体质指数为(2632±316)kg/m2，迟发冠心病组为(2496±369)kg/m2。早发冠心病组腰臀比为090±007，迟发冠心病组为088±007。早发冠心病组血清甘油三酯为(202±132)mmol/L，迟发冠心病组为(156±094)mmol/L。早发冠心病组胆固醇含量为(539±111)mmol/L，迟发冠心病组为(517±116)mmol/L。2组的收缩压、体质指数、腰臀比、血清甘油三酯和胆固醇含量等差异均有统计学意义(P005或P001)。