紫杉醇对人骨肉瘤细胞凋亡及对bcl2、bax基因表达的影响

作者：张春林，曾炳芳，董扬，张长青，眭述平，罗从风，陆男吉，高峰。

【摘要】 目的了解紫杉醇诱导人骨肉瘤细胞的凋亡效果，以及凋亡与bcl2和bax表达之间的关系。方法用不同浓度的紫杉醇作用于骨肉瘤细胞MG63。采用胎盼蓝染色法，于细胞记数板进行活细胞率检测计算。采用光镜和电子显微镜对细胞形态改变进行观测，采用原位缺口末端标记凋亡检测法（TUNEL）和流式细胞术（AnnexinVFITC PI）对细胞凋亡进行检测。采用免疫组织化学法对凋亡调节基因bcl2和bax表达进行检测。结果骨肉瘤活细胞率随着紫杉醇作用时间延长和浓度增高而降低。紫杉醇诱导骨肉瘤细胞MG63凋亡表现为典型的凋亡特征，包括：细胞形态学改变，细胞染色质浓聚，染色质新月形变，胞核碎裂等。TUNEL法检测到了细胞DNA片段的断裂。随着细胞凋亡的发生，开始出现G2/M期阻滞。紫杉醇可以降低凋亡相关基因bcl2的表达和增加bax基因的表达。结论紫杉醇可以通过时间依赖性和剂量依赖性方式，促使细胞G2/M期阻滞和抑制细胞有丝分裂，从而诱导人骨肉瘤细胞凋亡。这种凋亡可能受到凋亡相关基因bcl2低表达和bax高表达的调控。

【关键词】 紫杉醇；凋亡；骨肉瘤；bcl2；bax。

Abstract：ObjectiveTo investigate the apoptosis in human osteosarcoma cells induced by paclitaxel,and the relationship between this apoptosis and expression of bcl2 and bax.MethodsMG63 OS cells were treated with various concentrations of paclitaxel.Proliferation was determined by cell count in a cytometer chamber.Viability was assessed by typan blue dye exclusion.The cell morphologic alterations were visualized using light and transmitting electron microscope. The percentage of apoptosis of osteosarcoma cell MG63 was measured by TdTmediated dUTP Nick End Labeling technique(TUNEL) staining method and flowcytometry using Annexin V/PI double staining method after 0, 24, 48,72 and 96 hours of culture in the presence or absence of paclitaxel. The expression of apoptosisregulated gene bcl2 and bax were detected using immunohistochemical staining.ResultsA timedependent and dosedependent cell growth inhibition was shown after exposure to paclitaxel.Paclitaxel induced MG63 cells to undergo apoptosis with typical apoptosis characteristics, including morphological changes of chromatin condensation, chromatin crescent formation,nucleus fragmentation.The DNAcleavage was detected by using TUNEL assay.The cells treated with paclitaxel showed initially G2/M phase arrest,which was followed by apoptosis.Paclitaxel could reduce the expression of apoptosisregulated gene bcl2 and improved the expression of apoptosisregulated gene bax. ConclusionPaclitaxel is able to induce the apoptosis in human osteosarcoma cells through the initiation of G2/M phase arrest and inhibiting mitosis in both a timedependent and dosedependent manner.This apoptosis maybe mediated by downexpression of apoptosisregulated gene bcl2 and upexpression of apoptosisregulated gene bax.

Key words：Paclitaxel; Apoptosis; Osteosarcoma; bcl2; bax。

0引言。

细胞凋亡是细胞死亡的一种方式。其特征表现为主动的细胞自杀和DNA的破坏。细胞出现染色质浓聚，染色质新月形改变，胞核碎裂等[1,2]。一个细胞是否将发展为凋亡，部分原因依赖于调节细胞凋亡和促进细胞存活的蛋白质之间的平衡，例如bcl2和bax。bax的过表达可以促进细胞的死亡，而抑制细胞凋亡蛋白质（如bcl2）的过表达则可以抑制bax引起细胞凋亡的功能[3,4]。紫杉醇是一种从太平洋紫杉树树皮中提取出来的一种抗有丝分裂物质，它可使细胞内微管束稳定，微管蛋白聚合，抑制细胞有丝分裂中纺锤体的形成，抑制有丝分裂，使细胞阻滞于G2/M期，从而导致细胞凋亡[57]。已经证实紫杉醇对许多肿瘤具有细胞毒性作用（如卵巢癌，乳腺癌，白血病等）[57]。本实验旨在了解紫杉醇诱导人骨肉瘤细胞的凋亡效果，以及凋亡与bcl2和bax表达之间的关系。

1材料和方法。

1.1实验材料 紫杉醇购自北京协和制药厂。原位缺口末端标记凋亡检测（TUNEL）试剂盒购自Roche公司，AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒购自Beckman coulter公司。bcl2和bax单克隆抗体购自华美生物技术有限公司。

1.2细胞培养和条件人骨肉瘤细胞MG63获得自中山大学病理系（细胞源自美国ATCC细胞库）。采用不同作用时间（24~96h）和不同浓度（0.001~1μmol·L—1）紫杉醇对骨肉瘤细胞MG63进行作用。

1.3体外细胞生长抑制检测采用0.4%(W/V) 胎盼蓝染色法 (Gibco BRL)对MG63细胞生存能力进行评估，细胞培养48h后，被不同浓度的紫杉醇作用24~96h，然后用0.25%胰酶消化收集，采用0.4%胎盼蓝染色，于细胞记数板记数计算活细胞率。每种条件重复3次，取均值。

1.4电子显微镜观察细胞被0.1μmol·L—1紫杉醇作用后24~96h，用胰酶消化后收集，用4%戊二醛固定，浸泡于Epon821中，用包埋液包埋，于60℃烘箱内固化72h。超薄切片机切片约50~60nm厚，用3%醋酸铀枸橼酸铅双染色，然后用透射电镜观察，并拍照。

1.5TUNEL检测骨肉瘤细胞MG63凋亡采用原位缺口末端标记（TUNEL）检测试剂盒进行检测，阴性对照为不加入荧光素标记的dUTP。细胞用光镜和荧光显微镜观察。凋亡指数（AI）用以下公式来计算：AI=凋亡的细胞数目/总的细胞数×100%。

1.6流式细胞术检测采用流式细胞术（AnnexinVFITC PI）对细胞周期和细胞凋亡进行动态观察检测，在FACSort流式细胞仪(BectonDickinson)上进行。检测数据采用ModiFitl TV 2.0程序分析。

1.7免疫组织化学染色采用免疫组织化学LSAB法进行染色。出现棕色处表示抗原抗体结合处，用光镜观察并拍照(×200)，对照组不加一抗。阳性率(PR)用以下公式计算：PR=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.8统计方法采用Dunnett t (2 sided)检验ANOVA统计分析方法对资料进行统计分析。P0.05为差异有统计学意义。

2结果。

2.1体外细胞生长抑制的检测。

图1不同浓度紫杉醇作用不同时间骨肉瘤细胞MG63活细胞率（略）。

紫杉醇对MG63细胞有明显的生长抑制作用。在同一浓度条件下，活细胞率随着作用时间的延长而降低；在相同作用时间条件下，活细胞率随着药物浓度的增高而降低，呈现出时间依赖性和剂量依赖性关系，见图1。0.1μmol·L—1紫杉醇、5μmol·L—1 ADM、6.6μmol·L—1 DDP、1320μmol·L—1 MTX处理48h，活细胞率分别为62.3%、40.4%、71.5%、80.1%，四组的差异有统计学意义（F=687.9, P0.05）。

2.2细胞形态学改变经0.1μmol·L—1紫杉醇作用24h后，于透射电子显微镜观察下，可见骨肉瘤细胞MG63出现凋亡特征，包括染色质浓聚，染色质新月状改变，细胞核碎裂，见图2。

图2紫杉醇诱导骨肉瘤细胞MG63细胞凋亡（透射电子显微镜×4000）（略）。

2.3TUNEL检测阳性荧光染色和棕褐色染色位于细胞核中，结果显示经紫杉醇(0.1μmol·L—1)作用于骨肉瘤MG63细胞24~96h后，随着时间的延长，细胞凋亡指数明显地增加(P0.05) ，见图3。

2.4流式细胞术分析随着紫杉醇的作用时间延长，G0/G1期细胞比例明显下降，而较多的细胞阻滞于G2/M期。紫杉醇作用前骨肉瘤细胞MG63凋亡平均比例为1.76%，经0.1μmol·L—1紫杉醇作用24~96h，细胞的凋亡比例从17.5%上升至75.9%（0h 2.0%、24h 17.5%、48h 29.7%、72h 52.0%、96h75.9%）。当紫杉醇的作用浓度从0.001μmol·L—1增至1μmol·L—1，则平均细胞凋亡率从15.75%上升为56.86%。随着细胞凋亡率的增加，G0/G1期细胞比例下降，G2/M期细胞比例上升，图4略。

2.5bcl2蛋白表达阳性表达信号位于细胞质中。结果显示，经紫杉醇作用24~96h，bcl2蛋白阳性表达率随着作用时间增加而明显减低（P0.05）。这提示紫杉醇的作用可能会减低bcl2的表达。

2.6bax蛋白表达阳性表达信号位于细胞质中。结果显示，经紫杉醇作用24~96h，bax蛋白阳性表达率随着作用时间增加而明显升高（P0.05）。这提示紫杉醇的作用可能会升高bax的表达。