递归渐进光谱投影比较中药材铁线莲色谱指纹特征
作者：方洪壮 邹纯才 宗希明。
【摘要】 运用递归渐进光谱投影法，探索中药材东北铁线莲与棉团铁线莲石油醚提取物的色谱指纹特征化学成分的异同。指纹特征数据由高效液相色谱法获得，流动相为乙腈—1‰磷酸水溶液梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温20 ℃，光谱记录范围为200～400 nm。经比较，东北铁线莲和棉团铁线莲的色谱指纹特征中，至少分别有8和6种单独的化学成分存在，两者的共有的化学成分有14种。
【关键词】 递归渐进光谱投影法; 东北铁线莲; 棉团铁线莲; 指纹特征。
借助化学计量学方法分析色谱光谱二维数据中化学成分的异同，是中药指纹图谱研究的重要内容，已有光谱相关色谱、窗口目标检验因子分析、交替移动窗口因子分析等方法成功用于多种中药化学成分比较分析［1～3］。毛莨科植物东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr）和棉团铁线莲（Clematis hex—apetala Pall）的干燥根及根茎被收载在中国药典一部中的威灵仙药材项下［4］，近年来发现具有多种药理作用［5］。中药威灵仙的指纹图谱研究，现仅涉及其挥发油部分［6］，揭示威灵仙内在化学成分本质的差异，对相关的药学深入研究与临床使用有重要的意义。递归渐进光谱投影是新近提出的一种化学计量学多元分辨方法，可用于二维色谱数据重叠峰浓度窗口的确认［7］。本研究将递归渐进光谱投影法用于不同色谱指纹特征的化学成分的异同的分析，比较东北铁线莲和棉团铁线莲石油醚提取物的指纹图谱HPLC—DAD二维数据，发现东北铁线莲和棉团铁线莲石油醚提取部分中共有的化学成分有14种，两者单独的化学成分分别有8种和6种，东北铁线莲中较棉团铁线莲含有较多的齐墩果酸。实验结果为进步确定两种药材石油醚提取物中的化学成分及相关的药学研究奠定基础。
1方法原理。
设A和B分别为经色谱—光谱联用采集的两种中药样品的色谱指纹图谱的数据矩阵，矩阵的大小均为M ×N 阶，它们行的方向表征了色谱的流出信息（M个流出时间点），列的方向表征了光谱信息（N个吸收波长）。选择A中某一指纹特征峰的测定数据矩阵片断X，用渐近因子分析方法分别前向计算和反向计算获得其秩图［8］，根据秩图给出的组分数m，在A中设定m个前向和反向信息区。从第一信息区，选取一列数据作为代表性光谱s1 ，按设定的窗口尺寸w，从样品B中数据矩阵片断Y自色谱起始时间取w行子矩阵Y1 ，计算投影残差r1 1 : r1 1 =s1 T （I—Y1 Y1 + ）s1 （1）其中I为N阶单位方阵，“T”表示矢量的转置，“+”表示矩阵的广义逆;移动1个色谱时间点窗口，计算投影残差r‘2 ;不断移动窗口，运算至Y的色谱终点，得一系列投影残差r11 ，r1 2 ，…，r1 i ，…，r1 n 。由第二信息区，选取代表性光谱s2 ，对Y计算一系列投影残差r2 i =s2 T （I—Y2 Y2 + ）s2 。其中矩阵Y2 由样品数据Y子矩阵Y1 和光谱s1 构成:Y2 =［Y1 ， s1 ］（2）对每一信息区j，选取代表性光谱sj ，按Yj =［Y1 ， sj—1］计算一系列投影残差rj i =sj T （I—Yj Yj + ）sj 。以得到的m个投影残差矢量对n个保留时间作图，判定两样品中化学成分的异同。当在某一保留时间i处，样品B中含有样品A中的化学成分，rj i 的数值必将接近于零，反之，在该保留时间点样品B中缺少样品A中的化学成分。同理，以样品B为基准进行因子分析，选取代表性光谱，对样品A计算投影残差，可判定A中有无B中的化学成分。
2实验部分 2.1仪器与试剂 高效液相色谱仪:HP1100型，包括Agilent1100四元泵，HP1100二极管阵列检测器，HP色谱化学工作站（美国安捷伦科技公司）。东北铁线莲、棉团铁线莲:2005年9月采自伊春市亮子河林区，按中国药典2005版一部相关项下鉴别为药典规定的相应品种。齐墩果酸对照品（110709—200304）购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯;无水乙醇、盐酸与石油醚（60～90℃）为分析纯。
2.2样品制备。
2.2.1对照品溶液 取齐墩果酸对照品约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇适量使其溶解，加甲醇至刻度。制成1mg/ml 的齐墩果酸对照品溶液。
2.2.2供试品溶液 东北铁线莲及棉团铁线莲的干燥根和根茎，经粉碎后，分别过5号（180±7.6μm）药筛。分别取药材粉末1g，加乙醇50ml，加热回流2h，滤过，滤液浓缩至约20ml，加盐酸3ml，加热回流1h，加水10ml，放冷，加石油醚振摇提取3次，石油醚用量分别为20ml、10ml、10ml，蒸干石油醚，残渣用1ml甲醇溶解，经0.45 μm油性微孔滤膜过滤，制成东北铁线莲及棉团铁线莲的供试品溶液。
2.2.3空白溶液 取乙醇50ml，同供试品溶液制备方法，加热回流提取，石油醚残渣加甲醇1ml溶解制得。