胞内S—腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER—α表达的关系

【摘要】　　目的探讨S—腺苷同型半胱氨酸（S—adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体—α（estrogenreceptor—α，ER—α）基因表达变化的关系。

方法以分离的原代人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）为研究对象，经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3—deazaadenosine（DZA）处理24～72h后，反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度，利用细胞计数法、流式细胞仪和TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力，Westernblot法检测ER—α蛋白的表达，荧光定量—PCR检测其mRNA表达，甲基化特异PCR法检测ER—α基因启动子甲基化状态。

结果经DZA处理后，HUVEC胞内SAH浓度升高（P＜0.05），生长增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P＜0.05），ER—αmRNA和蛋白的相对表达量降低（P＜0.05），但DZA处理前后ER—α基因启动子甲基化状态不发生明显改变。

结论SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER—α的表达变化有关，但这种作用不是通过改变ER—α基因启动子的甲基化而实现的。

【关键词】S—腺苷同型半胱氨酸　人脐静脉内皮细胞　雌激素受体—α　甲基化 Abstract：ObjectiveToexploretherelationshipofinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularS—adenosylhomocysteine(SAH)accumulationandexpressionofestrogenreceptor—α(ER—α)inHUVEC.MethodsAfterisolatedprimaryHUVECtreatedwithout(normal)orwith3—deazaadenosine(DZA),apotentS—adenosylhomocysteinehydrolaseinhibitor,for24—72h,intracellularSAHlevelwasmeasuredwithreversedphasehigh—performanceliquidchromatography(RP—HPLC).TheproliferativeabilityofHUVECwasdetectedwithcytometry,flowcytometryandTUNELmethods.TheexpressionofER—αproteinandmRNAwasdeterminedwithWesternblotandquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(qRT—PCR)techniques,respectively.ThepromotermethylationofER—αgenewasanalyzedwithmethylationspecificPCR(MSP).ResultsTheresultsshowedthatthelevelofintracellularSAHwasincreasedinHUVECincubatedwithDZAcomparedtonormal.TheproliferativeabilityofHUVECweredecreasedandtheapoptoticratewasincreasedaftertreatmentwithDZA(P＜0.05).TherelativeexpressionofER—αmRNAandproteininHUVECtreatedwithDZAwaslowerthanthatofnormal(P＜0.05).ButtherewerenoobviouschangesofER—αgenepromotermethylationinHUVECbeforeandaftertreatmentwithDZA.ConclusionsThesefindingssuggestedthattheinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularincreasedSAHwascorrelativewithER—αexpressioninHUVEC.Thisactionwasnotrelatedwithitspromotermethylatedpatterns. Keywords:S—adenosylhomocysteine;humanumbilicalveinendothelialcells;estrogenreceptor—α;methylation 随着研究的深入，人们逐渐发现血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与血管疾病间并不一定存在着必然的因果关系，蛋氨酸的另一中间代谢产物S—腺苷同型半胱氨酸（S—adenosylhomocysteine，SAH）可能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一个伴随现象［1］。

近年来人们研究证实，动脉粥样硬化（artherosclerosis，As）相关基因启动子甲基化的改变，导致其转录失调在As形成过程中拌演着重要的角色［2］。

我们先前研究发现3—deazaadenosine（DZA）作为S—腺苷同型半胱氨酸水解酶的强效抑制剂，其应用在降低Hcy的同时，可以升高胞内SAH含量，降低DNA甲基转移酶1的表达，导致整体基因组低甲基化［3］。

为了进一步阐明SAH升高促进As形成的机制，本研究探讨了DZA对HUVEC增殖的影响与ER—α基因表达变化及其启动子甲基化的关系。

1材料和方法 1.1主要试剂 1640培养基干粉购于Hyclone公司；特级胎牛血清、DeathDetectionKit(POD原位细胞凋亡检测试剂盒)购于医学科学研究院生物工程研究所；SAH标准品和DZA购自Sigma公司；CytotoxicityDetectionKit购自(RocheMolecularBiochemicals公司；CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒购自BDBiosciencesPharmingen公司；UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（CatDV811A）购自宝生物工程（大连）有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基因医药科技有限公司；EZDNAMethylation—GoldKit(tm)试剂盒（Cat.D5005）购自ZYMORESEARCHCORP公司。

1.2细胞来源及分组 取足月妊娠分娩后的新生儿脐带20cm，1.25g/L胰蛋白酶消化分离内皮细胞，1640培养基，10%胎牛血清，5％CO2，37℃常规培养传代［4］。

考虑SAH不能直接通过哺乳动物的细胞膜，应用S—腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZA阻断SAH向Hcy的转化，从而升高胞内SAH的浓度。

实验分为以下4组：①对照组；②5μmol/LDZA处理组；③10μmol/LDZA处理组；④20μmol/LDZA处理组。

处理时间分别为24、48、72h，对照组用等体积的灭菌双蒸水代替DZA。

经CytotoxicityDetectionKit检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量完全排除了DZA的细胞毒性作用。

1.3反相高效液相色谱法（RP—HPLC）测定SAH浓度提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，按1∶1体积比加入等量三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA·2K)，漩涡振荡混匀，4℃13000r/min离心10min。

取20μl上清液上机分析胞浆SAH的浓度（nmol/mgprotein）。

检测条件：美国Waters公司高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，Waters1525BinaryHPLCpump高压泵，7125i进样器，Waters2966photodiodearraydetector紫外检测器；大连依利特HypersilBDSC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；柱温40℃；检测波长260nm；流动相50mmol/LNaH2PO4(pH=5.5)∶甲醇=9.5∶0.5,流速0.8ml/min；进样量20μl。

1.4细胞生长曲线绘制 以5×104个/ml密度接种HUVEC细胞于24孔培养板中，每孔2ml，分别加不同浓度的DZA干预培养1～4d，每天各取3孔，台盼蓝染色，显微镜下计数非染色的活细胞数，绘制生长曲线，并按如下公式计算细胞生长抑制率（GI）=（Nc—Nt）/Nc×100%，其中Nc和Nt分别为某一时相点对照组和处理组细胞数。

1.5流式细胞仪检测细胞周期相分布 按照BDBiosciencesPharmingen公司提供的CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒说明书进行。

细胞经处理后送至中山大学免疫教研室用BDFACScan流式仪（Macintosh操作平台，BDCellQuest1.0分析软件）分析细胞周期相分布。

1.6TUNEL检测细胞凋亡 按照DeathDetectionKit,POD原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。

主要步骤：4%多聚甲醛溶液室温固定HUVEC30min，PBS洗片，与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温孵育30min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX—100溶于0.1%枸鞣酸钠溶液）在冰浴中孵育2min，PBS冲洗2次，滴加50μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60min，PBS冲洗3次，在荧光镜下分析结果并照相。

1.7Westernblot法检测ER—α蛋白的表达 按照GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。

提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，取40g总蛋白进行SDS—PAGE凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5%tween—20的PBS缓冲液）封闭1h，1∶400稀释ER—α单抗4℃过夜，PBST漂洗10min×3，1∶40稀释生物素化二抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min×3，1∶40稀释HRP标记的链酶卵白素三抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min×3，DAB显色，照相并进行图象分析计算ER—α蛋白的相对表达量（正常组设为100）。

1.8qRT—PCR法检测ER—αmRNA的表达 HUVEC细胞经处理后送至中山大学达安基因有限公司检测ER—αmRNA的表达量。

用TRIZol提取总RNA，取4μlRNA模板做逆转录成cDNA。

内参β—actin采用RT—PCR荧光定量，ER—α采用巢式RT—PCR荧光定量。

β—actin引物：Forward5’—GCGCGGCTACAGCTTCA—3’，Reverse5’—TCTCCTTAATGTCACGCACGAT—3’，探针序列5’—FAM—CACCACGGCCGAGCGGGA—TAMRA—3’；ER—α外引物：Forward5’—TGCCAGGCTTTGTGGATTTG—3’，Reverse5’—GCCGCTGCATGACCTCCT—3’，内引物：Forward5’—TCTCGTCTGGCGCTCCAT—3’，Reverse5’—CTGGTTCCTGTCCAAGAGCAA—3’，探针序列5’—FAM—CACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAA—TAMRA—3’。

所有引物由上海生工合成。

ER—αmRNA的相对表达量为ER—α拷贝数与β—actin的拷贝数之比。

1.9MSP法检测ER—α基因启动子甲基化 按照UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Cat.DV811A）说明书提取DNA，按照EZDNAMethylation—GoldKit(tm)试剂盒（CatalogNos.D5005）说明书步骤对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。

通过设计ER—α甲基化（M）和非甲基化（U）引物，由上海生工合成，其中甲基化引物：Forward5’—GAACGAGTTGGAGTTTTTGAATC—3’，Reverse5’—CCGATCTAACCGTAAACCTACG—3’，扩增片段171bp；非甲基化引物：Forward5’—GAATGAGTTGGAGTTTTTGAATTGT—3’，Reverse5’—AAAAACCAATCTAACCATAAACCTACA—3’，扩增片段176bp。

该引物对应序列位于ER—α基因启动子的第二CpG岛（457bp—843bp）。

扩增条件：94℃5min，94℃30s，59.5℃30s，70℃30s，40循环，最后70℃延伸10min。

扩增产物2%凝胶电泳30min观察并照相。

1.10数据处理 用SPSS10.0软件进行统计学处理，数据用±s表示，采用Student’sｔ检验独立样本的差异性，least—squares法进行相关性分析，检验的显著性水平设在Ｐ＜0.05. 2结果 2.1胞内SAH浓度（图1） 对照组细胞内SAH的浓度为4.32±0.65nmol/mgprotein，培养24,48,72h后，其含量处于一个相对稳定水平。

但经DZA处理后，胞内SAH的浓度显著升高（Ｐ＜0.05），DZA的作用浓度越高、作用时间越长，胞内SAH含量增加越明显，提示DZA对胞内SAH浓度的增加效应具有时间和剂量依赖性。

2.2HUVEC细胞生长增殖能力（图2） 从HUVEC细胞的生长曲线反应DZA对血管内皮细胞生长增殖能力的影响。

按公式计算结果显示DZA处理24～96h对HUVEC细胞的生长抑制率为24.1%～69.6%，相关性分析显示SAH浓度与细胞数存在负相关（r=—0.89,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH升高能抑制HUVEC细胞生长增殖。

2.3细胞周期相分布 经三种不同浓度的DZA分别处理24,48,72h后，细胞周期相的百分比分布发生不同的变化，其中G1/G0期随着DZA浓度的增加和作用时间的延长，由正常对照的53.46±12.35%上升至58.21±13.24%～86.20±13.57%，S期由正常对照的35.19±8.96%下降至33.18±8.55%～8.10±2.46%，而G2/M期的变化无规律，提示胞内SAH升高主要使HUVEC细胞周期受阻于G1/G0期（Ｐ＜0.05），而S期减少（Ｐ＜0.05）。

2.4HUVEC细胞凋亡结果（图3） 　　 　　利用TUNEL法检测细胞凋亡时，在荧光显微镜下观察到凋亡的细胞呈阳性。

本实验中对照组可见少量荧光染色呈阳性的凋亡细胞，20μmol/LDZA处理24,48,72h后，荧光染色的强度逐渐增加，特别是作用72h后荧光强度最强，提示胞内SAH升高能使HUVEC血管内皮细胞产生凋亡。