高效液相色谱—蒸发光散射检测法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的

作者：库尔班江 苏文琴 张鹏威。

【摘要】 　　目的建立高效液相色谱—蒸发光散射检测（HPLC—ELSD）法测定金银花中绿原酸及木犀草苷的方法。方法采用Chromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)为色谱柱，用乙腈(A)—0.5%冰醋酸(B) 为流动相梯度洗脱，以蒸发光散射检测器检测绿原酸和木犀草苷。梯度程序为：0 min(A：10%，B：90%)→16 min(A：25%，B：75%)→22 min(A：50%，B：50%)；流速1.0 ml·min—1；检测器漂移管温度110℃ ，载气流速3.0 ml·min—1。结果绿原酸及木犀草苷的回归方程分别为：lgA=1.34lgm + 4.360，r=0.999 5；lgA =1.653lgm + 5.327,r=0.999 6。线性范围分别为5.0～45 μg和0.4～3.6 μg；平均回收率分别为99.94%(RSD=1.43%，n=5)和100.85%(RSD=1.78%，n=5)。结论该方法操作简便、结果准确，专属性强，分离效果和重现性好，可有效缩短总分析时间。为较全面控制金银花药材的质量控制提供了简便可靠的方法。

【关键词】 金银花 绿原酸 木犀草苷 高效液相色谱—蒸发光散射检测器 含量测定。

Abstract:ObjectiveTo develop a method for determination of chlorogenic acid(ChA) and galuteolin(Gal) in Flos Lonicerae Japonicae.MethodsAn HPLC equipped with ELSD method was applied to quantify chlorogenic acid and galuteolin．The analytical column was Chromasil C18(4.6 mm×250 mm,5.0μm)with the temperature of 30℃. The chromatogram for the ChA and Gal was developed on a gradient phase. Two solution were acetonitrile(A) and 0.5 % acetic acid solution and the gradient mode was as follows：0 min(A：10%,B：90%)→16min(A:25%,B:75%)→22 min(A：50%,B：50%). The flow rate was 1.0 ml·min—1．The temperature of drift tube was set at 110℃ and the flow rate of gas maintained at 3.0 ml·min—1．ResultsThe calibration curves of ChA and Gal were linear in the range of 5.0～45 μg and 0.4～3.6 μg，and the average recoveries were 99.94%(RSD was1.43%) and 100.85%(RSD was 1.78%) respectively．ConclusionThe method is accurate，specific，and can shorten the total analytical time of Flos Lonicerae Japonicae．。

Key words:Flos Lonicerae Japonicae； Chlorogenic acid； Galuteolin； HPLC—ELSD； Determination 　　金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，红腺忍冬L. hypoglauca Miq.，山银花L. confusa DC.，或毛花柱忍冬L. dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花［1］。金银花药用历史悠久，为常用的清热解毒药，具有清热解毒、散风消肿的功能，主治风热感冒、肺炎、咽喉肿痛、急性细菌性痢疾、婴幼儿腹泻等证［2，3］。其主要含有绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮、皂苷等［4］。绿原酸常作为金银花质量控制的指标成分。2005版《中国药典》金银花项下增加了木犀草苷的含量测定。因为绿原酸和木犀草苷的最大吸收波长不一致，所以需要分别用HPLC法测定绿原酸和木犀草苷的含量，增加了检测工作量。而研究表明对有紫外吸收的药物用UV法和ELSD法测定结果是一致的［5，6］。ELSD是一种通用型检测器，可以克服紫外检测器的以上缺点，因此本文采用ELSD检测器对其进行同时测定。结果表明此法准确，精密度、重现性好、回收率高，为金银花药材的质量控制提供了快速、准确的测定方法。

1 仪器与材料。

1.1 仪器。

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，安捷伦公司）；Alltech 2000型蒸发光散射检测器（美国，Alltech公司）；WWK无油空压机(天津，兴国科技)；SB2200超声波清洗器(上海超声仪器厂)；METTL ER220电子天平(美国，梅特勒公司)。

1.2 材料。

绿原酸（购于中国药品生物制品检定所，批号110753—200413），木犀草苷（购于上海郎中堂化剂公司，纯度大于98%）；从不同产地收集5批金银花样品，通过天津药物研究院张鑫新老师鉴定，天津、河南、山东产为忍冬Lonicera japonica Thunb.,陕西产为红腺忍冬L. hypoglauca Miq.，新疆产为山银花L. confusa DC.；水为饮用纯净水（杭州娃哈哈集团），冰醋酸(天津奥凯化工贸易有限公司)。其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果。

2.1 色谱条件与系统适用性试验。

Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30℃ ；梯度洗脱，流动相A为：乙腈，流动相B为：0.5%冰醋酸水溶液,梯度程序为：0 min(A：10%， B：90%)→16 min(A：25%，B：75%)→22 min(A：50%,B：50%)，每次重新开始梯度前，以0 min时比例流动相平衡10 min。流速1.0 ml·min—1；ELSD检测器参数为：漂移管温度110℃，气体流速3.0 ml·min—1。理论塔板数按木犀草苷峰计算不低于2 000，与相邻峰的分离度大于2.0。色谱图见图1。

2.2 溶液的配制。

2.2.1 对照品溶液 　　精密称取绿原酸及木犀草苷适量，分别置10 ml量瓶中，加甲醇溶解、定容，分别制成2.5 mg/ml的绿原酸标准溶液和0.2 mg/ml的木犀草苷标准溶液，置棕色瓶中备用。

2.2.2 供试品溶液　　精密称取金银花干燥细粉(过60目筛)约5.0 g，加石油醚（60～90℃）40 ml，浸泡2 h，过滤，滤渣室温挥干石油醚，置于具塞三角瓶中，用40 ml（20 ml×2）70%乙醇超声提取两次，30 min/次，过滤，合并滤液，用70%乙醇溶液洗涤滤渣，将滤液60℃减压蒸干，用甲醇定量转移至5 ml容量瓶中，摇匀，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。