六味地黄汤对雌性致衰模型小鼠生殖器官影响的实验研究
【摘要】 目的观察六味地黄汤（LW）对雌性致衰小鼠生殖器官的影响。方法小鼠颈背部皮下注射D — 半乳糖建立衰老模型，同时给予六味地黄汤、己烯雌酚治疗，然后检测六味地黄汤对β—内啡肽（β—EP）、血清雌激素（E2）、孕激素（P）含量以及对卵巢、子宫形态学的影响。结果六味地黄汤能够提高β—内啡肽含量，增加小鼠阴道脱落细胞涂片内角化上皮细胞和表层细胞，卵巢重量增加。结论六味地黄汤具有雌激素样作用，可能通过调理下丘脑—垂体—卵巢轴(HPO)的功能，使卵巢功能恢复。
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Liuwei Dihuang Tang on causing senility to ovaria of mice. MethodsTo establish senility model through subcutaneous injection of D—galactogen into the neck and back of mice, which were subsequently treated with Liuwei Dihuang Tang and ethylene cyclohexne. Meanwhile, to observe the effects of Liuwei Dihuang Tang on the content of β—endorphin, sero—estrogen and progestogen, and on ovaria and uterine histomorphology. ResultsLiuwei Dihuang Tang could improve the content of β—endorphin, increase the cornified and epithelial cell and epidermal cell in the vaginal exfoliated cell smear of mice. ConclusionLiuwei Dihuang Tang serves the same function as estrogen, which restores the normal functioning of ovaria by regulating the workings of subthalamus—hypophysis—ovarian axis.
Key words：Liuwei Dihuang Tang; POF 六味地黄汤（LW）是中医滋补肾阴的代表方剂。由熟地、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮6味药组成,其特点是长于三阴(肝脾肾)并补而以补肾为主的方剂。长期临床观察此方有抗衰老功能，但从未看到抗衰老实验室对小鼠生殖器官细胞、形态结构研究的报道。本研究通过把六味地黄汤用于实验小鼠活体内对卵巢、子宫组织细胞、形态结构观察，从而为六味地黄汤对卵巢早衰分子生物学研究提供较可靠的实验依据。 卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指卵巢功能提前衰退，表现为妇女40岁之前非生理性的月经停止，伴有潮热、原发及继发不孕、全身和生殖器萎缩，卵泡刺激素(follicular stimulating homone,FSH)升高(FSH40IU/L)及E2下降。目前病理机制不甚清楚，而建立POF动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有重要意义。由于半乳糖血症患者常表现为原发性闭经或卵巢早衰，且有报道动物体内的半乳糖增多可引起类似与卵巢早衰的改变，故本课题组采用D —半乳糖建立小鼠卵巢早衰动物模型［1］，通过观察LW对小鼠下丘脑－垂体－卵巢轴（HPO）的调节作用及对小鼠生殖器官形态学影响，探讨LW对POF的治疗机制，指导临床诊断和治疗。
1 材料与仪器。
1.1 动物。
雌性昆明种小鼠60只，8～12周龄，体质量25 ～30 g，由河南省南阳医专实验动物中心提供。饲养环境安静，温度25～35℃，相对湿度为50％～60％，自由进食、水。
1.2 药品与试剂。
六味地黄汤草药药材购于河南省南阳市医药公司，由南阳医学高等专科学校药理教研室按比例组方 ，经煎制、过滤、浓缩为1 g/ml (以生药汁) 六味地黄汤口服液，高压灭菌，O℃冰箱保存备用。D — 半乳糖为上海恒信制药厂产品，批号为20010218。 用灭菌生理盐水配制成50 g/L,0℃冰箱保存备用。乙烯雌酚由上海衡山药业有限公司生产，批号为000201。雌二醇（E2）放射免疫药盒购自天津德普公司；孕醇（P）放射免疫药盒购自中国医学科学院和医学技术中心；β—内啡肽（β—EP）放射免疫药盒购自海军放免技术中心。其他制剂均为国产分析纯。
1.3 仪器和设备。
(2/2)VI普通Ⅰ类B型脱水机，孝感宏业TS—12L；日本原装进口（1/2）JVCTK—C921EC显微镜摄像机；日本原装进口OLYMPUSCX31显微镜；德国原装进口mICROMGMBH Hm200切片机；CSˉ摊片机。电子体温计，DT一ITB型;电子天平，JD2000 — 2 ;Y～计数器，GAMMA —C120。
2 方法。
2.1 衰老动物模型的建立。
采用D—半乳糖亚急性衰老模型建立法。D —半乳糖按每只小鼠经背部皮下注射D — 半乳糖0.3 ml/（kg·d），注射42 d。
2.2 实验分组 将60只小鼠随机分成正常对照组（A）、衰老模型组(B)、六味地黄汤治疗1组(C)，六味地黄汤治疗2组(D)，乙烯雌酚组(E)，每组12只。A组、B组各鼠每天灌胃生理盐水20 g·kg—1，同时B组，C组，D组，E组各鼠每天经背部皮下注射D—半乳糖0.3 ml·kg—1，连续给药42 d。从11天开始，C组，D组分别灌服六味地黄汤（原汁1 g/ml浓度）20 g·kg—1·d—1或40 g·kg—1·d—1，E组乙烯雌酚0.7 mg·kg—1·d—1灌胃，连续给药32 d。
2.3 观察指标及方法。
2.3.1 动情周期的测定给药两周，逐只连续观察受试动物外阴部、阴道上皮脱落细胞动情周期变化。用消毒棉签插入小鼠阴道约0.5 cm，轻轻转动后取出，将棉签上的阴道脱落细胞均匀涂于洁净的载玻片上，待涂片自然风干后用碱性美蓝溶液染色5 min，然后用蒸馏水冲洗，自然风干后镜检，观察细胞形态，确定动情周期。每日下午定时阴道涂片、H—E染色，细胞学检查。
2.3.2 P，E2，β—内啡肽检测各组连续灌胃治疗2周后，称量体重并在大鼠动情间期，按放射免疫药盒操作说明测定β—内啡肽及雌、孕激素的含量。每只鼠取血清200 μl，血清量不足的动物将血清合并后检测。成批检测P，E2,β—内啡肽，留样时要求用1%肝素和抑肽酶抗凝，迅速低温4℃离心，取血浆低温－20℃保存待测。
2.3.3 生殖器官体质量观察42 d采血后断头法处死动物，摘取子宫、卵巢，剔除脂肪和其他组织，滤纸稍拭后，分别放入电子分析天平精确称出湿重。
2.3.4 形态学观察分组编号并浸入10％福尔马林固定、包埋、切片、HE染色、封片，进行组织学观察 。
2.3.5 统计学处理:用SPSS13.0进行统计处理,统计学方法为样本均数的T检验。