猪苓菌丝发酵培养及其多糖的药用研究
猪苓属于担子菌纲，多孔菌属。猪苓渗湿利尿，入脾、肾、膀胱经，历来主治小便不利、水肿胀满、脚气、泄泻等症。近年来据报道猪苓水溶性提取物―――多糖在抗肿瘤方面有显著效果。因此我们用发酵手段获得猪苓菌丝以扩大药源，从中提取多糖成分用于抗肿瘤，结果认为猪苓菌丝多糖是一种非特异性免疫刺激剂，它可以加强细胞免疫和体液免疫功能。本文主要报告猪苓菌丝发酵培养，发酵条件的确定，猪苓菌丝多糖的提取以及药用研究。
1 材料与方法。
1.1 实验材料。
1.1.1 菌株 猪苓菌F8601由本所分离所得。
1.1.2 培养基及发酵条件 （1）斜面培养基及培养条件:淀粉3%:葡萄糖2%;蛋白胨2%;琼脂2%;pH7.0。温度26℃，培养5～7天。（2）摇瓶培养基及发酵条件:淀粉1.5%;葡萄糖2%;蛋白胨0.5%;MgSO 4 0.06%;（NH 4 ） 2 SO 4 0.3%;KH 2 PO 4 0.15%;K 2 HPO 4 0.15%;VB 1 1mg%，VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%，pH7.0。温度26℃，摇床转速:180～220rpm，装量:100ml/500ml瓶，接种量:1接种铲，时间:48h。（3）种子罐培养基及发酵条件:淀粉1.5%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;（NH 4 ） 2 SO 4 0.15%;KH 2 PO 4 0.15%;VB 11mg%;VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%;豆油0.3%:pH7.0。温度26℃，罐压0.3～0.5kg/cm 2 ，通气量:1∶0.5～1∶1，搅拌转速:400rpm，装量:50%～60%，接种量:0.5%～0.8%，时间:48～60h。（4）发酵罐培养基及发酵条件:淀粉1.5%:葡萄糖1.5%;蛋白胨1%;（NH 4 ） 2 SO 4 0.2%;KH 2 PO 4 0.15%;VB 1 1mg%;VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%;豆油0.3%;pH7.0。温度26℃，罐压0.3～0.5kg/cm 2 ，通气量:1∶0.5～1∶1，搅拌转速:400rpm，装量:50%～60%，接种量:15%～20%，时间:36～48h。
1.2 操作方法 （1）培养过程:保藏菌种传斜面，经26℃培养5～7天接摇瓶，26℃培养2～3天进种子罐（接种量:0.5%～0.8%），26℃培养2～3天，再接发酵罐（接种量:15%～20%），26℃培养1～2天，放罐。（2）发酵后处理:用三角式离心机离心发酵液，菌丝于50℃～60℃烘干得到干品，滤液浓缩（5%～10%）。
1.3 分析测定 （1）pH值:精密pH试纸。（2）糖、氮含量测定:测种子罐，发酵罐培养液中总糖，氨基氮的含量，每8h测1次。（3）显微镜观察:观察菌生长情况，发酵是否正常。（4）菌丝浓度测定:（发酵液—上清液上清液 ×100%）（5）收率:（菌丝干重配料体积×100%）。
1.4 猪苓菌丝多糖的提取 （1）提取方法:取猪苓干菌丝若干公斤，加入5倍量的蒸馏水，加温115.5℃提取3次，时间为1.5，1.0，0.5小时，合并3次提取液滤过。除去不溶性杂质，滤液减压浓缩，在搅拌下加入乙醇，使含醇量达到80%，静置12h，滤取析出物，低温干燥。将所得之干燥物溶于蒸馏水中，加热煮沸后，趁热滤除不溶物，滤液在搅拌下加入乙醇，使含醇量达到80%，静置24h，滤取析出物，用80%乙醇洗涤3次，低温干燥，即得粗多糖。（2）多糖的鉴别:①纸层析:用毛细管吸取粗品水溶液，点于新华层析纸上，用正丁醇:无水乙醇:水（3.5∶3∶3）展开，以氨制硝酸银试剂（0.1N硝酸银与5N氨水1∶1混合液）喷雾，于120℃烘烤5～10min，显褐色斑示多糖位置。②多糖确证实验:取粗品水溶液10ml，加入过量的碱性酒石铜试液，加温煮沸2min，将产生的红色沉淀滤除，滤液仍保持蓝色。取此滤液用硫酸酸化，加温煮沸水解10min后，用10%氢氧化钠溶液中和，再加入适量碱性酒石酸铜试剂，加温煮沸，产生砖红色氧化亚铜沉淀。以上结果表明:粗品除含多糖外，尚含蛋白质杂质。（3）多糖粗品的精制:将多糖粗品溶于一定体积的蒸馏水中，准确量取若干毫升，在搅拌下滴加1%鞣酸（药用规格）溶液，边加边升温，煮沸后离心弃去沉淀，至取上清液加入1滴鞣酸溶液不混浊止（注意勿使鞣酸过量），换算出粗品溶液所需加入鞣酸的量。操作时先将全量药液煮沸，在搅拌下缓缓加入鞣酸溶液，待反应完全后，继续煮 沸15min，加入2%的活性炭搅拌10min，用布氏漏斗脱炭滤过，滤液加入乙醇使含醇量达到70%，静置24h后，滤取析出物，用70%乙醇反复抽洗沉淀，至检查洗液中不含鞣酸止。将湿品溶于一定量的20%的热乙醇中，通过置于布氏漏斗中中性氧化铝层，微微减压后，使药液缓缓流出，继续加入60℃热蒸馏水洗脱，收集流出液，减压浓缩成一定体积，加入乙醇，使含醇量达到70%，放置即析出白色絮状沉淀，过滤收集沉淀，低温干燥，即得猪苓多糖纯品。