解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

作者：陈益山 曹文富 焦颖华 肖柯。

【摘要】 目的 观察中药复方解聚复肾宁(JJFSN)对糖尿病 (DM)大鼠肾脏的保护作用。方法 建立链脲佐菌素（STZ）诱导的DM大鼠模型，将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组，并设正常对照组。各组大鼠采用相应的干预措施处理12 w。常规方法检测各组大鼠尿白蛋白排泄率(UAER)等指标，免疫组化法检测肾血管内皮生长因子（VEGF）和骨形成蛋白7（BMP7）表达，Western印迹检测肾组织血小板衍化生长因子B（PDGFB）的表达，透射电镜观察肾脏超微结构。结果 模型组大鼠除肾BMP7表达显著减少外，其余指标均显著增高,肾脏超微结构改变明显；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组除肾BMP7显著高于模型组(P＜0.05)外，其余指标均显著低于模型组(P＜0.05)，肾脏超微结构改变明显改善；JJFSN+厄贝沙坦组各项指标改善明显优于模型组、JJFSN组和厄贝沙坦组(P＜0.05)，但未达到正常对照组水平。结论 JJFSN对DM大鼠肾脏有明显保护作用。

【关键词】 解聚复肾宁；糖尿病。

【Abstract】 Objective To investigate the effect of Jiejufushenning（JJFSN） on renal protection in diabetic nephropathy rats. Methods The diabetic SD rats induced by STZ were divided into 4 groups: model, JJFSN, irbesartan and JJFSN combined with irbesartan and control group. Rats in each group were respectively treated for 12 weeks by the appropriate intervention methods. The relative urinary albumin excretion rate (UAER), and other indicators were detected by routine analysis methods, and VEGF and BMP7 in renal tissue were detected by immunohistochemical techniques, and PDGFB in renal tissue was detected by Western blot, and ultramicrostructure of kidney was observed by transmission electron microscope. Results In addition to renal cortex BMP7 expression of a significant reduction, the other indicators were significantly higher in diabetic rats. The ultramicrostructure of kidney was noticeably changed. While the above indexes in JJFSN, irbesartan and JJFSN combined with irbesartan groups were significantly better than in diabetic control group (P＜0.05), and ultramicrostructure of kidney changed was improved, and the improvement of all indexes in JJFSN combined with irbesartan group was most significant (P＜0.05). Conclusions Protective effect of JJFSN on diabetic nephropathy in rats is obvious. 　　【Key words】 Jiejufushenning; Diabetes。

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症之一。目前，现代医学除积极控制血糖和血压、限制蛋白质摄入、应用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂外，尚缺乏确实有效的方法。本实验旨在观察解聚复肾宁(JJFSN)对DN大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法。

1.1 药物和试剂 JJFSN由黄芪、生地黄、黄连、黄芩、丹参、葛根等十几味组成，原药购自重庆桐君阁药房，经重庆医科大学中医学院中药研究室鉴定并制备成浓缩煎剂，含生药2 g/ml；厄贝沙坦为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司产品，批号：0703116；链脲佐菌素(STZ)为ALEXIS公司产品，批号：L18034；血管内皮生长因子（VEGF）兔多克隆抗体（BA0407）、骨形成蛋白7（BMP7）兔多克隆抗体（批号：BA0665）、血小板衍化生长因子（PDGFB）兔多克隆抗体（BA0519）、山羊抗小鼠/兔IgG免疫组化检测试剂（SA1050）为武汉博士德生物工程有限公司产品，DAB显色剂为北京中杉金桥有限公司产品，抗兔IgGHRP（Sigma,A6154）。

1.2 动物 健康雄性SD大鼠，8周龄，体重200～220 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物合格证号：0052769。

1.3 主要仪器 H7500透射电镜、ROCHE MODULAR全自动生化分析仪、微量血糖测定仪、Olympus公司图像采集系统、北京医学图像分析管理系统、LabworksTM扫描分析软件系统。

1.4 分组、造模及给药 按参考文献〔1〕稍加修改建立模型，取SD大鼠50只禁食12 h后，用0.1 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液（pH＝4.2，4℃）配制浓度为2％的STZ溶液，按60 mg/kg左下腹腔单次注射STZ，制造DM模型。72 h后尾尖取血测空腹血糖，血糖≥16.65 mmol/L确定为DM成模大鼠，共成模40只。将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、JJFSN+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组各10只。另取不注射STZ大鼠10只作为正常对照组，腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾尖取血测血糖，血糖均在4.7～8.3 mmol/L。造模7 d后,JJFSN组用JJFSN按29.87 g·kg—1· d—1灌胃；厄贝沙坦组用厄贝沙坦按50 mg·kg—1·d—1灌胃；JJFSN+厄贝沙坦组用JJFSN按29.87 g·kg—1·d—1和厄贝沙坦按50 mg·kg—1·d—1灌胃，每日上午1次，正常对照组和模型组大鼠每日上午用等量蒸馏水灌胃。室温18～20℃，相对湿度69％，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食。共喂养12 w。

1.5 标本收集与检测 实验结束前1 d，用代谢笼留取24 h尿液，记录总量，离心，—80℃冰箱保存。实验结束，所有动物于空腹状态称体重（BW），10％水合氯醛腹腔麻醉,剖腹分离双侧肾脏，右肾用冰生理盐水清洗，吸干水分，称肾重（KW），左肾取少部分皮质制备1 mm3数块，用4％戊二醛固定，待做透射电镜观察，取1/2肾组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫组化。余肾脏标本均用液氮快速冷冻,—80℃冰箱保存，备行Western印迹检测等。24 h尿白蛋白排泄率（UAER）用ROCHE MODULAR全自动生化分析仪测定。将石蜡包埋的肾组织制成厚4 μm切片，按照免疫组化三步法检测肾组织VEGF和BMP7的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统及北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。取冰冻组织100 mg提取蛋白，蛋白考马斯亮蓝法定量，取蛋白SDSPAGE电泳，然后转移至聚偏氟乙稀（分子杂交，PVDF）膜上，入含6%脱脂牛奶（pH7.2）的磷酸缓冲液（PBS）中封闭室温1～2 h，置4℃冰箱过夜，洗膜后用一抗(PDGFB兔多克隆抗体)进行杂交，再用二抗(抗兔IgGHRP)进行杂交，化学发光试剂检测进行放射自显影。用LabworksTM扫描分析软件系统定积分光密度值。

1.6 统计学处理 数据用x±s表示，应用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，组间差异性比较采用单因素方差分析。

2 结果。

2.1 各组大鼠KW/BW和UAER比较 模型组大鼠的KW/BW、UAER显著增高(P＜0.05)；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组上述指标显著低于模型组(P＜0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组两项指标改善明显优于模型组、JJFSN组和厄贝沙坦组(P＜0.05)，但未达到正常对照组水平；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠KW/BW和UAER比较（略）。

与模型组比较：1)P＜0.05；与JJFSN+厄贝沙坦组：2)P＜0.05，下表同。

2.2 各组大鼠PDGFB表达 模型组PGGFB表达(129 800±1 873.8)明显高于正常对照组(432 621.5±1 114.3)(P＜0.05)；JJFSN组(98 329±1 588.1)、厄贝沙坦组(98 181.0±1 628.2)和JJFSN+厄贝沙坦组(83 130.5±1 045.4)PDGFB表达明显低于模型组(P＜0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组较JJFSN组和厄贝沙坦组表达降低更为显著(P＜0.05)，但仍高于正常对照组；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。