大肠埃希菌AcrABTolC外排泵表达水平调控机制的研究进展
作者：马红霞 马述清 刘玉堂 伞治豪。
【摘要】 AcrABTolC外排泵的过量表达是引起大肠埃希菌多重耐药的主要原因。AcrABTolC外排泵的表达水平主要受其正向调节因子、负向调节因子以及环境中的化学物质等调节。本文综述了近年来AcrABTolC外排泵调控因子方面的研究进展。
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【关键词】 大肠埃希菌； 耐药性； 外排泵； AcrABTolC 论文网。
ABSTRACT Overexpression of the AcrABTolC efflux pump is the major contributor to multidrug resistance of Escherichia coli. The expression level of the AcrABTolC efflux pump is principally regulated by its upregulation factors, downregulation factors and surrounding chemical materials, etc. This article reviews research progress of regulation factors of the AcrABTolC efflux pump for the past few years.
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KEY WORDS Escherichia coli; Drug resistance; Efflux pump; AcrABTolC 代写论文。
药物外排泵是能将有害底物排除菌体外的一组转运蛋白，其过量表达可引起细菌对抗生素耐药的机制早在20世纪70年代中期就引起了 科学 家们的关注［1］。根据氨基酸序列的同源性，通常将细菌的药物外排泵分为5个超家族：易化子(major facilitator，MF)家族、多药和毒物外排(multidrug and toxic efflux，MATE)家族、耐药结节细胞分化(resistancenodulationdivision，RND)家族、小多重耐药(small multidrug resistance，SMR)家族以及ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)家族［2］，其中，除ABC家族以ATP为外排所需能量外，其余均以质子泵获取外排所需能量［3］。 论文代写。
大肠埃希菌是发现药物外排泵最多的一种细菌，一般认为在其约30种外排泵中AcrABTolC外排泵是最主要的外排泵。AcrABTolC外排泵属于RND家族，由AcrA、AcrB以及TolC三部分组成，其中AcrA为连接内膜组分和外膜孔道的脂蛋白，AcrB为药物质子转运子，TolC为大肠埃希菌对有机溶剂耐受所必需的外膜孔道［4，5］。AcrABTolC外排泵过量表达时，可对广泛应用的抗生素包括镰孢菌酸、四环素、氯霉素、新霉素、红霉素、夫西地酸、萘啶酸、氯比西林、氟喹诺酮类、β内酰胺类、利福平及SDS、吖啶橙、结晶紫、溴乙啶、吐温X100等多种化合物产生耐药性［6～8］，因此，AcrABTolC外排泵在革兰阴性菌多重耐药性的产生过程中发挥了重要作用［9］。 代写论文。
当大肠埃希菌的AcrABTolC外排泵过量表达时，大肠埃希菌对许多药物的耐药性随之增强，但当其过量表达超过一定水平时，又可明显排出一些代谢中间产物而对菌体细胞产生毒性，因此AcrABTolC外排泵的表达可能受到多种调控机制的影响而被精确地调节［10］。AcrABTolC外排泵在最低水平表达时，其表达量可被局部阻抑蛋白AcrR调控；AcrABTolC外排泵在最高水平表达的稳定时期，其表达量可能被整体的应激条件正向调节，如渗透性及乙醇性应激等；AcrABTolC外排泵在中间水平表达时的调控机制已成为研究人员最为关注的热点。 论文代写。
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AcrABTolC外排泵在最低水平表达时主要受AcrR的负向调控，其负向调控作用与acrAB的诱导作用无关［11］。acrR基因的无意义突变使acrAB基因的表达水平可能提高2倍；AcrR缺失时，MarA则进一步促进acrAB基因转录水平的增加［12］。在我国畜牧业集约化和管理水平相对较低的情况下，AcrR与MarR的共同突变可提高动物源性大肠埃希菌对多种抗生素的耐药性［13］。 论文代写。
在4%的乙醇与0.5mol/L氯化钠的共同作用下或在LB培养基的稳定生长期内，尽管acrAB基因对其它调控因子产生的强烈反应仍然存在，但acrR的负向调节作用丧失，导致大肠埃希菌的acrAB基因的转录增加，上述因素统称为“一般窘迫信号(global stress signals)”［14］。 论文代写。
大肠埃希菌的周质连接蛋白MppA对acrB的转录亦起负向调节作用。有人推测MppA可能通过减小膜两侧质子压力差而导致转运子AcrB的能量缺乏。
另据报道携带mppA无意义突变的大肠埃希菌K12株，可产生过量的转录激活因子MarA，引起AcrABTolC外排泵的过量表达，表现出对多种抗生素和环己烷显著增强的耐药性；此外，mppA的无意义突变尚可引起细胞质的GadA、GadB和一些尚不能确定的细胞质膜蛋白的表达量增加以及外膜蛋白OmpF的表达量显著降低，因此mppA可调节包括marA基因在内的若干基因［15］。 毕业论文。
2.1 MarA对AcrABTolC外排泵的调节 论文网。
AcrABTolC外排泵的表达主要受XyIS/AraC家族的三个调控因子(MarA、SoxS和Rob)调节(图1)。三者均需结合到DNA上而发挥作用，且与DNA结合区域的氨基酸序列均高度保守［16］。
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MarA是由129个氨基酸组成的典型调控因子，大小与XyIS/AraC家族调控因子的DNA结合区相当。MarA在细胞内的表达水平受MarR控制，能结合MarO的二聚蛋白MarR在抑制自身表达的同时，尚可抑制marRAB两个操纵子的表达。MarA亦可提高自身的转录水平，marA作为一个单体可与marRAB启动子上方marO连结，激活marRAB的转录，提高MarA在细胞内的表达量，随后与mar调节基因启动子邻近的acrAB和tolC结合，促进其转录［17］(图1)。此外，MarA的表达诱导micF反义RNA的合成，可下调外膜孔蛋白OmpF的表达以及促进AcrABTolC外排泵的过量表达［18］。 毕业论文。
2.2 SoxS对AcrABTolC外排泵的调节 毕业论文。
SoxS是由107个氨基酸组成的小分子蛋白质，大小也与XyIS/AraC家族调控因子的DNA结合区相当。蛋白组学及遗传学常规分析结果显示，SoxS可激活17个基因或操纵子的表达，包括编码Mn超氧化物歧化酶的sodA、编码NADPH铁氧化还原蛋白的fpr、编码反义RNA的micF、编码环磷鸟苷水解酶的ribA、 编码黄素氧化还原蛋白A和B的fldA与 代写论文。
图1 MarA、SoxS、Rob、SdiA和FIS蛋白对大肠埃希菌acrABtolC基因表达的调控图谱［17］fldB、编码核酸内切酶IV的nfo、编码多重抗生素耐药性操纵子的marRAB、编码硝基还原酶的nfsA(mdaA)、编码6磷酸葡萄糖脱氢酶的zwf、编码铁摄取阻抑物的fur、编码C延胡索酸酶的fumC，编码顺乌头酸酶的acnA，编码核糖体蛋白S6的修饰基因的rimK、tolC、acrAB以及功能未知的inaA，其中SoxS引起的tolC、acrAB、micF和rimK基因的激活使大肠埃希菌及沙门菌对多种药物的耐药性增强［19］。本课题组的研究资料表明，从我国兽医临床分离的高水平多重耐药动物源性大肠埃希菌的soxS基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的个别突变位点可能影响了该菌体的AcrABTolC外输泵的表达水平，使其多重耐药水平明显提高。
超氧化物自由基化学物质的增加可促使SoxR调节蛋白氧化成其活性形式，促进SoxS的过量产生，但SoxS又可限制其自身合成［20］。 论文网。
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Rob不同于MarA和SoxS，是由289个氨基酸组成的能结合低分子量效应基因单独区域的较大蛋白质，在正常情况下以高浓度存在，且正常水平的Rob能够完全渗透目标启动子，调节8个目的基因的表达，包括inaA、marRAB、aslB、ybaO、mdlA、ybiS、yfhD以及galT［21］。 代写论文。
TolC的表达水平亦可受RobA、MarA及SoxS的正向调节(图1)。研究人员发现，在tolC基因的上游(—96bp至—73bp)有一与marrobsox盒相一致的序列，提示tolC可能是marrobsox调节子的成员之一，其表达受转录激活蛋白的直接调控，但这些激活蛋白与tolC序列的结合机制仍待通过研究加以证实［22］。 代写论文。
在大肠埃希菌中rob的无意义突变可增加其对有机溶剂的敏感性，Rob的过量表达可增加其对有机溶剂的耐受性［23］。另外的研究表明，在mar和sox缺失的情况下，可通过癸酸和胆酸盐诱导Rob，导致AcrABTolC的表达量增加，使大肠埃希菌对抗生素的耐药性增强［24］。
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对我国部分地区分离的不同动物源性大肠埃希菌进行耐药性检测及其相关耐药基因的同源性比较分析的研究结果表明，大肠埃希菌的rob基因的序列与动物源性有关，部分耐药水平较高的大肠埃希菌的rob基因中出现了无意义突变，推测rob基因可能不是我国动物源性大肠埃希菌中AcrABTolC外排泵的主要调控基因［25］。 论文网。
辅助激活蛋白FIS可进一步提高MarA、SoxS及Rob对marRAB的正向调节功能，推测其可能有助于维持DNA的超螺旋结构，稳定某些启动子的局部DNA结构，对应不同的生长条件而改变其转录活性，且能与marO内的一个特殊位点结合［17］(图1)。
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研究发现，SdiA为大肠埃希菌调节因子LuxR的同系物，起到宽范围基因的正向调节作用。SdiA的过量表达可激活acrAB基因的表达，反之SdiA的无意义突变能降低AcrB蛋白的表达水平［26］。课题组在对我国兽医临床分离的部分高水平多重耐药大肠埃希菌中sdiA基因的同源性比较分析中发现，不同源性sdiA基因存在多个突变位点，多个突变位点是否导致SdiA的过量表达，进而激活acrAB基因的表达以提高其多重耐药水平还有待于进一步研究。 代写论文。