β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响

【摘要】 目的: 探讨大鼠β细胞素在胰腺干细胞的增殖和转分化为胰岛细胞中的生物学作用。方法: 分离并培养大鼠胰腺干细胞于CMRL1066和无血清DMEM/F12培养液中, 不同浓度大鼠β细胞素处理后, 双硫腙染色, 放免法检测胰岛素分泌量。结果: 在大鼠β细胞素浓度为20～30 mg/L时, 大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组; 其胰岛素分泌量明显高于对照组(P0.01)。结论: 大鼠β细胞素具有促进胰腺干细胞转分化为胰岛β细胞并增强其胰岛素分泌的作用。

【关键词】 β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞。

胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点, 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞, 这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明, β细胞素（betacellulin, BTC）属于表皮细胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2, 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。

1 材料和方法。

1.1 材料。

SD大鼠（体质量250 g, 雌雄不限, 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食, 手术前1 d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供, Ⅴ型胶原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin　selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亚砜（DMSO）、 烟碱购于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。

1.2 方法。

1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养。

采用宋振顺等［5］的方法, 首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织, 然后采用非连续密度梯度离心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。

1.2.2 胰腺干细胞免疫组织化学染色。

分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS缓冲液冲洗玻片, 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜, 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色, 显微镜观察, 自来水冲洗, 苏木精复染, 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。

1.2.3 双硫腙染色与计数。

双硫腙(DTZ)为螯合剂, 可与铅、 铜、 锌等螯合, 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌, 双硫腙染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释, 0.22 μm滤膜过滤, DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径50 μm计数染色的胰岛样细胞团, 50 μm者不计。

1.2.4 胰岛素检测。

胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆, 培养于24孔培养板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后, 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后, 取培养液上清, 采用放免法测定胰岛素含量。

1.2.5 实验分组。

按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞, 并将其设为正常对照组, 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素, 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共设立5个实验组。

1.2.6 统计学处理。

采用Student t检验方法, 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。

2 结果。

2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化。

收获的非胰岛细胞于24～48 h内部分黏着于培养瓶底。在第1～3天换液时, 大量漂浮于培养液中的外分泌细胞和胰岛被弃除。培养5 d内, 单个贴壁细胞迅速扩增为鹅卵石样小细胞片进而分裂增殖成单层细胞。培养第3天改用无血清培养液及加入霍乱毒素, 可明显地促进导管上皮细胞的生长和抑制成纤维细胞的污染。细胞培养第7天胰岛样细胞芽团开始从细胞片或单层细胞的中央或边缘出现, 同时鹅卵石样细胞片迅速扩大。此后大量胰岛样细胞芽团和囊状细胞团出现。双硫腙染色呈弱阳性。第21～27天, 大量较成熟的胰岛样结构出现,双硫腙染色强阳性（图1）。

2.2 免疫组织化学。

（1）CK19染色: 细胞培养第1天, 4孔板中的部分细胞呈ＣＫ19抗体染色强阳性。此时的细胞多为贴壁的单个或小细胞片, 亦可见较多阴性反应的细胞碎片。培养3 d后, 细胞片不断扩大, 第7天起, 可见胰岛样细胞芽团出现并逐渐增多, 绝大多数细胞集落和胰岛样细胞芽团均为ＣＫ19强阳性（图2）。（2）PDX1染色: 培养第1天, 4孔玻板中的细胞大部呈PDX1抗体染色阳性。但在同一细胞片中细胞染色程度不一, 部分呈强阳性, 部分呈弱阳性, 少数细胞为阴性。第7天起, 可见胰岛样细胞芽团逐渐增多; 第11～27天, 胰岛样细胞芽团不断增大, PDX1抗体染色呈强阳性(图3)。

2.3 BTC对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响 　　在正常对照组中, 胰岛克隆为（139±8.5）个/g胰腺, 各实验组培养液中加入不同浓度的大鼠β细胞素后, 胰岛克隆的数量明显增加, 在大鼠β细胞素的浓度为20～30 mg/L时, 培养液中胰岛样细胞团克隆的数量增加最为明显(P0.01)。提示大鼠β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团具有明显的促进作用（图4）。