可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究
作者：王燕燕，宋兴福，崔向军，黄骥 毕业论文。
【摘要】 目的 研究 青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cystEine containing aspartate9,caspase9)和caspase3活性的 影响 。 方法 Art处理A549细胞，流式细胞计数(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡，比色法检测caspase9活性，western blot检测caspase3变化。结果FCM显示A549细胞经100mg/L Art作用24h，出现S期细胞减少(P0.01)，G2/M期细胞数目增多(P0.01)，细胞凋亡率增加(P0.0)。不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art作用A549细胞24h，caspase9活性呈浓度依赖性增加，分别为对照组的9.87倍、23.33倍（P0.01）、38.47倍（P0.01）和60.47倍（P0.01）。Western blot 显示A549细胞经100mg/L Art作用6、12、24h后，细胞浆中caspase3活化，分别为对照组1.2倍、1.6倍(P0.01)、1.8倍(P0.01)。结论青蒿琥酯可通过增加caspase9和caspase3的活性，诱导A549细胞凋亡，为阐明Art的抗癌机理，指导青蒿琥酯用于肿瘤 治疗 提供实验依据。
【关键词】 青蒿琥酯；A549细胞；细胞凋亡；caspase9；caspase3 论文代写。
Abstract：Objective To investigate the effects of artesunate on apoptosis of human adenocarcinoma cell line A549 cells and activation of cystEIne containing aspartate 9(caspase9) and cysteine containing aspartate 3(caspase3). MethodsA549 cells were treated with artesunate, cell cycle phase‘s distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. Activation of caspase9 was identified by colorimetric assay. Change of caspase3 was detected by western blot. ResultsWith artesunate treatment, marked cell accumulation in G2/M phase was observed after 100mg/L Art exposure for 24h. In addition, the percentage of apoptosis increased, from (3.5±0.7)% in control cultures to approximately （19.4±1.5）% after 100mg/L Art treated for 24h. caspase9 colorimetric assay showed basal levels of caspase9 activity in A549 cells, and after Art treatment, caspase9 activity increased in a dosedependent manner. After A549 cells treated with 100mg/L Art for 6h, 12h and 24h, the activity of caspase3 increased with fold of 1.2, 1.6(P0.01) and 1.8 (P0.01), respectively. ConclusionArt is of strong anticancer effect which is associated with activation of caspase9 and caspase3 specific pathway.
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Key words：Artesunate; A549 cells;Apoptosis;caspase9;caspase3 论文网。
0引言。
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青蒿素及其衍生物是我国自主知识产权的高效抗疟药。近年来的研究发现青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用以外，对人类多种肿瘤细胞在体外有杀伤作用或抑制作用[15]，但其作用机制尚不十分清楚。为了探讨青蒿素的衍生物之一青蒿琥酯(Artesunate,Art)的抗癌机制，我们采用Art诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，并检测caspase9和caspase3活性变化，结果表明，Art可使A549细胞中caspase9和caspase3的活性明显增加，现报道如下：
1.1主要试剂及仪器Art，桂林南药股份有限公司，批号050201；1640培养基（RPMI medium 1640）和胰蛋白酶，Gibco公司；胎牛血清（Fetal calf serum,FCS），杭州四季青公司；碘化丙啶（PI）,Sigma公司；caspase9 colorimetric assay kit，Calbiochem公司；ECL kit，Kirkegaard Perry Laboratories公司；兔多克隆抗caspase3抗体（H277,sc7148,可识别caspase3酶原和p11、p17、p20 caspase3）和βactin(C2,sc8432)均为Santa Cruz产品；丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、SDS、Triscl、牛血清白蛋白（BSA）、硝酸纤维素膜（NC膜）、考马斯亮兰R250、过硫酸胺（AP）均为Amersco产品。酶标仪(GENios VA200)，奥地利TECAN公司；流式细胞仪（EPICS ALTRA II），美国Beckman公司；凝胶成像系统(BioID)，法国VL公司。
1.2细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学 中国 典藏物保存中心，接种于含10% FCS的RPMI1640培养液中，置37℃、5% CO2孵箱中常规培养，每2～3d传代1次。 代写论文。
1.3流式细胞计数（Flow Cytometry, FCM）检测细胞周期和凋亡100mg/L Art处理细胞，24h后收集细胞，用冷PBS（0.01M pH 7.4）漂洗，滴加80%乙醇—20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min，冰上2min，PI综合染液（含100mg/L PI、0.1% TritonX100）暗处孵育30min。上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。细胞周期统计及凋亡 分析 采用数据获取软件CELLQuest及DNA分析软件ModFit LT。
1.4检测caspase9活性A549细胞分别暴露于不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art，24h后采用比色法检测细胞浆中caspase9活性。检测方法参照caspase9 colorimetric assay kit说明书，简述如下：先采用终浓度分别为0、50、100、200和400mg/L标准物的吸光度绘制标准曲线。收集5×106细胞，加入50μl预冷的细胞裂解液，冰上孵育10min，4℃、10000×g离心1min，收集上清液为细胞抽提物， 计算 蛋白浓度。96孔板中加入用缓冲液稀释的蛋白样本50μl、2×反应缓冲液（含10mM DTT）50μl、4mM LEHDpNA底物5μl，37℃孵育1h，酶标仪上读取405nm波长处的吸光度值（A值），caspase9活性单位(U)=(各组A值—凋零组A值)/标准曲线斜率，每组重复4孔。 毕业论文。
1.5Western blot检测细胞浆caspase3蛋白A549细胞暴露于100mg/L Art，分别在6、12、24h后按 文献 方法[6]提取总蛋白，SDSPAGE 电泳后，依次进行凝胶转膜、封闭、一抗和二抗杂交、ECL显色、X光片曝光，依据目标蛋白条带的灰度判断表达情况。 论文代写。
1.6统计学分析实验数据用均数±标准差(±s)表示，均数间比较采用单因素方差分析，均在SPSS13.0软件上完成，显著性检验为P0.05。 论文代写。
2.1Art诱导细胞凋亡表1显示，Art可以抑制A549细胞的DNA合成、诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。
表1100mg/L Art作用A549细胞24h对细胞周期和细胞凋亡影响（略）。
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2.2Art对caspase9活性的影响表2显示Art诱导A549细胞浆的caspase9活性增强,呈浓度依赖性。 代写论文。
表2Art对A549细胞浆中caspase9活性的影响（略） 论文代写。
2.3Art对caspase3蛋白的影响细胞凋亡时，细胞浆中pro caspase3分解产生p11、p17、p20 caspase3，可经Western blot检测。在本实验中，A549细胞经100mg/L Art作用6、12、24h后，细胞浆中caspase3出现32kDa和17kDa条带，经密度灰度扫描定量分析，6、12、24h的caspase3分别为对照组1.2倍、1.6倍(P0.01)、1.8倍(P0.01)，见图1。