降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

【摘要】 目的: 构建降钙素原（PCT）原核表达载体, 制备其多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定。方法: 以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 在大肠杆菌中分别表达GSTPCT和HisPCT融合蛋白, 用HisPCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb。通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价; 用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性。使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性。 结果: 构建了重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 并在大肠杆菌中表达、 纯化。经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶256 000。制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白。获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白。 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础。

【关键词】 降钙素原 原核表达 抗体制备 鉴定。

降钙素原（procalcitonin, PCT）来自定位于第11号染色体上（11P15, 4）的单拷贝基因, 该基因由2800个碱基对组成, 含6个外显子和5个内含子, 基因全长Mr约7 600。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体proprocalcitonin, 包括N端84个氨基酸、 活性降钙素（CT, 32肽）和降钙蛋白（katacalcin, 21肽）三部分, 分别由2肽（LysArg）及4肽（GlyLysLysArg）连接。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉nProCT端单一序列, 生成116个氨基酸的PCT。PCT是无激素活性的降钙素前肽物质［1］。在正常情况下, 具有激素活性的降钙素是在甲状腺滤泡旁细胞产生与分泌, 并由细胞内特殊蛋白酶分解PCT成降钙素。正常人血中PCT浓度非常低, 然而在严重的细菌感染和脓毒症时, 在外周血液中发现完整的PCT浓度升高。我们构建了重组表达载体, 获得融合表达蛋白后, 免疫家兔和BALB/c小鼠, 制备抗PCT抗血清和抗PCT的单克隆抗体（mAb）, 并进行特性鉴定, 为进一步研究PCT的功能及其应用提供有力的工具。

1 材料和方法。

1.1 材料 TT细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心; 大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。原核表达载体pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、 ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自Omega公司。BALB/c小鼠和大耳白兔子（2～2.5 kg, 雄性）购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。鼠抗His标签mAb、 HRP羊抗鼠IgG、 HRP羊抗兔IgG、 FITC羊抗鼠IgG、 ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法。

1.2.1 PCT抗原的制备和纯化 根据Human Protein Reference Database中提供的PCT的氨基酸序列, 并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析, 以GenBank发表的核酸序列为准, 综合设计引物。在其上游引物设计EcoRⅠ酶切位点, 下游引物设计XhoⅠ酶切位点, 片段长度270个碱基（PCT的27～116位氨基酸）, 从TT细胞提取总RNA, 反转录合成cDNA, 以cDNA为模板扩增目的片段。回收的目的片段、 pGEX4T1和PET32a载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后, 分别进行连接, 转化大肠杆菌, 阳性克隆经测序正确后抽提质粒, 进行诱导表达。PCT在BL21细菌中以可溶性形式表达, 表达后用亲和层析法进行了纯化。

1.2.2 HisPCT融合蛋白的Western blot分析 将重组蛋白经常规SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上, 封闭液封闭后, 加入鼠抗His mAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗鼠IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。

1.2.3 兔抗人PCT抗血清的制备 将纯化的PCT融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后, 每只家兔皮下多点注射融合蛋白800 μg; 初次免疫4周后加强免疫1次, 接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血, 分离血清, 分装后置—20℃保存。

1.2.4 兔抗PCT血清的特性鉴定 （1）ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用GSTPCT融合蛋白以0.1 mg/L的浓度包被。按梯度稀释抗血清, 每孔加入100 μL（阴性对照为正常兔血清, 空白对照为二抗稀释液）, 37℃孵育30 min洗涤3次后, 加入1∶10 000稀释的HRP羊抗兔IgG, 37℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。（2）Western blot检测PCT融合蛋白: 重组蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后, 将蛋白质转移至PVDF膜上, 封闭液封闭后, 加入兔抗人PCT血清与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗兔IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。（3）间接免疫荧光检测: 当TT细胞长到1×106/瓶时铺6孔板, 培养72 h后, 40 g/L多聚甲醛（10 g/L Triton）固定10 min; 空气干燥5 min; PBS清洗标本3次, 各2 min; 羊血清（用1×PBS按1∶10稀释）在37℃封闭30 min; 滴加兔抗人PCT抗血清, 4℃过夜; PBS清洗标本3次, 吹干; 滴加1∶200稀释的FITC羊抗兔IgG, 室温孵育30 min; PBS洗3次; 加染核试剂Hochest（用1×PBS按1∶5 000稀释）, 室温孵育30 min, PBS洗3次; 800 mL/L甘油封片, 镜检拍照。

1.2.5 鼠mAb的制备 3只6～8周龄, 体质量为17～21 g的BALB/c小鼠。首次免疫时, 每只小鼠分别经皮下多点注射接种HisPCT 80 μg, 加等体积弗氏完全佐剂。首免4周后进行第2次免疫, 每只小鼠分别经皮下多点注射接种HisPCT 40 μg, 加等体积弗氏不完全佐剂。第2次免疫后7 d, 经尾静脉采血, 用ELISA法测定血清抗体的效价。选择抗体效价高的小鼠, 于融合前4 d, 在尾静脉注射HisPCT 40 μg/只, 加强免疫1次。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆化, 并按常规方法制备mAb腹水。

1.2.6 抗PCT mAb的特性鉴定 （1）mAb的腹水效价及Ig亚类的测定: 腹水中mAb的效价采用间接ELISA法测定。采用Hbt小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗PCT mAb的Ig亚类。（2）mAb的特异性鉴定: Western blot检测, 将纯化后GSTPCT和HisPCT加入还原性SDSPAGE上样缓冲液中, 于100℃变性10 min。取重组蛋白进行SDSPAGE, 并转至PVDF膜, 封闭, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP羊抗鼠IgG, ECL显色后观察结果。间接免疫荧光检测, 用杂交瘤细胞上清为一抗检测PCT在TT细胞中的表达, 具体实验方法同1.2.4。

2 结果。

2.1 HisPCT融合蛋白的表达与鉴定 SDSPAGE电泳检测, 观察到含重组质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT的菌经IPTG诱导表达后, 在相对分子质量（Mr）约36 000和29 000处均出现1条蛋白带, 其大小与预测的PCT融合蛋白的Mr相一致, 融合蛋白主要以可溶性形式表达, 经纯化后蛋白纯度可达到90%（图1）。通过Western blot检测, 应用抗His的抗体能够在相应位置检测到His和HisPCT融合蛋白（图2）。

图1 PCT融合蛋白的SDSPAGE分析（略）。

Fig 1 SDSPAGE analysis of PCT fusion protein。

M: Protein marker; 1: Purified GSTPCT fusion protein; 2: Purified HisPCT fusion protein.

2.2 兔抗PCT抗血清的特性鉴定 （1）ELISA检测板用GSTPCT融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。间接法检测抗体的效价为1∶256 000。用兔抗PCT抗血清对融合蛋白进行Western blot实验, 证实在Mr约29 000和36 000处各有一特异性的条带, 说明表达的PCT蛋白具有较好的免疫学活性。阳性对照（pET32a代替抗原）在相应位置出现Mr为19 000的阳性条带, 阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图2）。（2）间接免疫荧光检测: 将TT细胞铺6孔板, 培养72 h后, 滴加兔抗PCT抗血清, 4℃过夜后, 加FITC羊抗兔IgG, 在荧光显微镜下观察, 兔抗PCT抗血清与TT细胞质中的天然PCT有阳性反应, 呈现明显的绿色荧光。