呼吸道合胞病毒感染中性粒细胞Toll样受体4表达及其功能

作者：徐文飞, 刘恩梅, 王莉佳, 李欣, 刘炜。

【摘要】 目的: 观察呼吸道合胞病毒（RSV）感染中性粒细胞Toll样受体4(TLR4)的表达及对炎症介质产生的影响, 探讨地塞米松(DEX)干预对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达及炎症介质的作用。方法: RSV感染中性粒细胞, 流式细胞术（FCM）检测中性粒细胞TLR4表达及代表中性粒细胞呼吸爆发功能的过氧化氢（H2O2）, ELISA检测中性粒细胞培养上清的IL6和IL8水平, 并观察阻断TLR4信号通路及DEX干预对RSV感染中性粒细胞功能的影响。结果: (1) RSV感染中性粒细胞TLR4表达增加; RSV感染中性粒细胞IL6的产生增加, 阻断TLR4信号传导, RSV感染组IL6产生减少 (阻断组IL6: 391.307±43.45 ng/L; RSV感染组IL6: 466.03±36.478 ng/L; 对照组IL6: 21.205±15.059 ng/L); RSV感染中性粒细胞IL8和H2O2的产生均明显增加, 阻断TLR4信号传导对IL8和H2O2的产生没有影响。(2)DEX下调RSV感染后中性粒细胞TLR4表达, 减少RSV感染的中性粒细胞产生IL6、 IL8和H2O2的产生; 阻断TLR4, 与DEX协同抑制RSV感染中性粒细胞IL6的产生, 逆转DEX对RSV感染中性粒细胞H2O2产生的抑制作用。结论: TLR4信号通路在RSV感染后中性粒细胞炎症介质产生及呼吸爆发功能中起重要作用; 阻断TLR4信号通路和DEX联合作用可能成为临床治疗的新靶点。

【关键词】 呼吸道合胞病毒; 中性粒细胞; Toll样受体4。

呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus, RSV) 为副黏病毒科肺炎病毒属有包膜非节段性的单负链RNA病毒。作为引起婴幼儿下呼吸道感染最重要和常见的病毒病原体, 导致婴幼儿喘息性疾病的发生。 近年来发现Toll 样受体 (TLR) 在抗病原微生物免疫防御反应中起重要作用, 通过识别细菌、 病毒和环境中相应抗原的保守结构, 启动天然免疫应答, 是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLR4是RSV融合蛋白 (F) 蛋白的识别受体［1］, 在RSV感染发生发展中起着重要的作用。中性粒细胞是RSV感染气道炎症发生发展起关键作用的炎症细胞, RSV感染后上下气道内聚集了大量中性粒细胞及其产物［2］。中性粒细胞聚集通过分泌细胞因子、 趋化因子、 活性氧、 蛋白酶等活性介质, 介导炎症反应。有研究证实［3］TLR4表达对中性粒细胞的聚集、 黏附、 凋亡、 细胞因子或趋化因子以及活性氧产生起重要调控作用。迄今尚未见RSV感染的特异性治疗报道。临床常用糖皮质激素尤其是地塞米松（DEX）治疗RSV感染引起的喘息, 但存在争议。已有的研究显示［4］, DEX可下调心、 肺组织及单核细胞TLR4表达, 抑制NFκB活性及TNFα等炎症因子产生, 促进中性粒细胞凋亡, 改变Thl／Th2细胞偏移等机制发挥抗炎作用保护机体。有关DEX的作用与中性粒细胞TLR4表达的相关报道甚少。本研究拟从RSV感染对中性粒细胞TLR4表达与功能影响, 探讨RSV感染免疫发病机制, 并观察DEX对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达及功能的影响, 为寻找防治RSV感染后气道炎症产生的新方法提供理论依据。

1 材料和方法。

1．1 材料 选取正常体检患儿(男性年龄4～6岁), 经知情同意, 每人采取外周静脉血5 mL, 加入20 IU/mL肝素抗凝, 用于分离中性粒细胞。RSV病毒株由北京病毒研究所馈赠。人IL6和IL8 ELISA试剂盒由RD公司提供。人FITCTLR4流式抗体由Serotec公司提供, HTA125(TLR4单克隆抗体)由ABCAM公司提供。人淋巴细胞分离液为天津TBD公司产品。地塞米松磷酸钠注射液由湖北天药药业股份有限公司提供。荧光显微镜为Olympus (BH2)产品, 流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。

1．2 方法。

1．2．1 中性粒细胞的分离 参照文献［5］介绍的方法分离中性粒细胞, 细胞密度为109个/L, 纯度95％, 存活率98％。

1．2．2 RSV的制备 RSV迅速解冻后加入单层制备的HEP2细胞中, 在普通光学显微镜下观察细胞病变, RSV形成多核巨细胞或称融合细胞, 病变达70%以上收集病毒悬液, 离心取上清, 分装, 冻存于液氮罐中。病毒蚀斑技术测定病毒滴度。

1．2．3 中性粒细胞TLR4的检测 除空白组外加入RSV, 感染复数MOI=10, 37℃、 50 mL/L CO2孵育30 min。PBS缓冲液冲洗2次, 加入FITCTLR4流式抗体, 4℃孵育, 空白组和RSV组均设IgG2a同型对照, 避光孵育30 min, PBS缓冲液冲洗, 40 g/L多聚甲醛固定, 流式细胞仪检测。

1．2．4 中性粒细胞产生H2O2的检测 除空白组外加入RSV, MOI=10, 37℃、 50 mL/L CO2孵育30 min。PBS缓冲液冲洗2次, 加入双氢罗丹明123（DHR123）避光孵育30 min, 流式细胞仪检测。

1．2．5 中性粒细胞产生IL6和IL8的检测 除空白组外加入RSV, MOI=10, 37℃、 50 mL/L CO2孵育18 h, 离心收上清保存于—80℃, ELISA试剂盒检测。

1．2．6 HTA125阻断TLR4 加入HTA125（10 mg/L） 37℃、 50 mL/L CO2孵育30 min, 加入RSV, 余步骤同上。

1．2．7 DEX干预观察中性粒细胞TLR4以及功能的变化 实验组按照1 mmol/L的浓度加入DEX, 流式细胞术检测中性粒细胞TLR4的表达和对产生H2O2等超氧化物的功能, ELISA试剂盒检测对炎症细胞因子产生的影响; 加入HTA125阻断TLR4后再同前试验。

1．2．8 统计学分析 所有数据均采用SPSS10．0统计软件进行处理, 数据用x±s表示, 组间比较采用配对t检验。