高效液相色谱法测定诃子中鞣花酸的含量
作者：贝玉祥， 杨阳， 郭英， 李正全，高云涛。
【摘要】 目的建立诃子提取物中鞣花酸含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法色谱条件Shim—pack CLC—ODS色谱柱(150 mm×6 mm，5 μm)，柱温30℃,用CH3OH—EtOAc—KH2PO4/H3PO4(0.05 mol/L)(体积比30∶2∶68)作为流动相,检测波长为254 nm。结果鞣花酸在0.268～5.36 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率为98.42%,RSD为1.13%(n=5)。结论该方法快速、简便、准确，可用于诃子中鞣花酸的含量测定。
Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of ellagic acid in the extract of Terminalia .MethodsHPLC separation was carried out in an Shim—pack CLC—ODS columm (150 mm×6 mm，5μm)with the mobile phase consisted of methanol ethyl acetate, 0.05 mol/L KH2PO4—H3PO4(34∶2∶64) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 254 nm. ResultsThe linear range was 0.268～5.36 μg/ml for ellagic acid. The average recovery was 98.42% , and RSD was 1.13% ( n=5).ConclusionThis method is rapid, accurate and reproducible for determination of ellagic acid in the extract of Terminalia.
Key words： Terminalia; Ellagic acid; HPLC。
诃子Terminalia chebula Rotz.又名诃黎、诃黎勒、随风子，为使君子科植物的果实[1]。 诃子作为中药在中医临床上广泛使用，用于油脂抗氧化方面的研究在国内已见有专门报道[2]。诃子果实中含丰富的鞣质和多元酚类，约为30%～40%[3]已有文献报道，鞣质和多元酚类具有较好的抗氧化性[4]。
鞣花酸(2，3，7，8—tetrahydroxy benzopyrano[5， 4，3—cde]benzopyran—5，10—dione) 是一种植物多酚类化合物[5](如图1)，为诃子中主要的活性成分之一，广泛存在于各种自然的软果、坚果等植物果实中。它对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，它能与人体内有害自由基结合，具有强力祛癌变功效，可以抗衰老、增加机体免疫， 还具有降压、镇静作用，对多种细菌、病毒有很好的抑制作用[6]。因此鞣花酸有“克癌之星”“致癌物清除剂”之美称。从机理上讲， 鞣花酸是一种抗氧化剂[7]，它可作为保健食品添加剂，研究、开发本品具有较高的经济价值和广泛的应用范围。
本实验建立了HPLC法测定诃子中鞣花酸含量的方法，并对文献报道的多种色谱条件进行了比较[8～10]，表明本文方法精确可行。
1 仪器与试剂。
日本岛津SPD—10AT高效液相色谱仪; SPD—10Avp检测器;SIL—10AP自动进样器;超纯水器(arium 611UF，Sartorius);超声波清洗器(AS3120A，天津瑞森特);电子天平(AdventurerTM，AR2140，上海奥豪斯公司); 旋转蒸发仪(R—200，瑞士Buchi)。岛津UV2100型，甲醇为色谱纯;实验用水为超纯水，蒸馏水自制，其它试剂均为国产分析纯试剂。
鞣花酸对照品(购自购自成都普瑞法科技开发有限公司),纯度≥98%。诃子(产自云南临仓和缅甸)。
图1 鞣花酸的结构。
2 方法。
2.1 色谱条件色谱柱为岛津Shim—pack CLC—ODS柱(150 mm×6 mm，5 μm)， 柱温30℃，用CH3OH—EtOAc—KH2PO4/H3PO4(0.05 mol/L)(体积比34∶2∶64)作为流动相，检测波长为254 nm。
2.2 对照品溶液的制备精密称取鞣花酸对照品6.7 mg，加甲醇25 ml制成每毫升含0.268 mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备精密称取诃子粉 (均过60目筛)约1 g，置于100 ml具塞三角烧瓶中，加60%乙醇25 ml，超声提取60 min，过滤，用60%洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液， 50℃旋转蒸干，加甲醇定容至10 ml，以0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液，进样10 μl。
2.4 标准曲线制备精密吸取对照品溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μl进样，测定峰面积，并以色谱峰峰面积(A)对对照品的量(m)回归(包括原点)，得回归方程为A= 7.577 7E+06 m + 9.670 0E+05(R=0.999 9)。鞣花酸0.268～5.36 μg范围内，线性关系良好。
2.5 精密度和样品重复性实验重复进对照品溶液10 μl/次，测得鞣花酸峰面积相对标准偏差RSD=0.9%(n=6);对同一样品按拟定的方法作多次测定，其含量相对标准偏差RSD=2.1%(n=5)。
2.6 回收率实验采用加样回收法取已知量的诃子，分别添加一定量的鞣花酸对照品，按拟定的方法测定，结果平均回收率为98.42%,RSD为1.13%(n=5)。
2.7 样品测定 按上述“2.3”项样品液制备方法测定云南产诃子和缅甸产诃子中鞣花酸的含量,云南产诃子和缅甸产诃子的鞣花酸含量分别为0.573 mg/g(RSD=3.4 %)和0.567 mg/g(RSD=4.2%)。