TGF—β1对胃癌细胞和耐药性胃癌细胞生长及p16，cyclin D1蛋白表

作者：李柱虎 ，任香善 ，李美子。

［摘要］ ［目的］ 探讨TGF—β1对胃癌细胞株SNU—601/WT和耐药性胃癌细胞株SNU—601/cis2生长p16，cyclin D1蛋白表达的影响. ［方法］ 将经TGF—β1处理SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞作为实验组，未经处理的作为对照组，利用MTT法检测TGF—β1对两组细胞生存率的影响，并利用免疫细胞化学方法检测各组细胞内p16，cyclin D1蛋白表达情况. ［结果］ 实验组SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞生存率呈时间依赖性下降，与对照组比较均有显著性差异;SUN—601/WT，SNU—601/cis2实验组细胞内p16蛋白表达呈时间依赖性增强，而cyclin D1蛋白表达则无明显变化. ［结论］ TGF—β1具有抑制SNU—601/WT胃癌细胞和SNU—601/cis2耐药性胃癌细胞生长作用，其机制可能与增强p16蛋白表达有关，而与cyclin D1蛋白无明显相关性.

［关键词］ 胃肿瘤;耐药性;基因，p16。

ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the effects of TGF—β1on the cell growth of gastric cancer cell line SNU—601/WT and drug resistant cell line SNU—601/cis2and the expression of p16and cyclin D1protein.METHODS SNU—601/WT and SNU—601/cis2cell lines were divided into the experimental and control groups.The effect of TGF—β1on survival rate of these cell lines were measured by MTT assay.The protein expression of p16and cyclin D1were detected by immunocytochemical staining.RESULTS In the experimental group，the growth rate of SNU—601/WT and SNU—601/cis2were decreased along with the time process.All were significantly different compared with the control group.In the mean while，the growth rate of drug resistant cell line was lower than that of the gastric cancer cell line at48and72h.TGF—β1was a time—dependent increase incells positive for p16expression in the experimental group.But，the expression of cyclin D1were without difference in the experimental group and control group.CONCLUSION TGF—β1can inhibit the growth of SNU—601/WT gastric cancer cell and SNU—601/cis2drug resistant cell，and increase p16protein expression，but has no significant influence cyclin D1protein expression.

Key words:stomach neoplasms;drug resistance;genes，p16。

β转化生长因子（transforming growth factor—be—ta，TGF—β）是分子质量为25ku的蛋白质，对多种类型细胞生长具有抑制作用 ［1，2］ .本研究通过观察TGF—β1对胃癌细胞和耐药性胃癌细胞生长及p16，cyclin D1蛋白表达的影响，探讨了TGF—β1对胃癌细胞，尤其是耐药性胃癌细胞生长的影响及其机制.

1 材料与方法。

1.1 材料 SNU—601/WT胃癌细胞株和SNU—601/cis2耐药性胃癌细胞株由韩国朝鲜大学校耐药性细胞研究中心提供;TGF—β1为美国Biovi—sion公司产品，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为美国JBI公司产品，MTT试剂为美国Sigma公司产品，p16，cyclin D1试剂均为Santa Cruz公司产品;ABC试剂盒为美国Zymed公司产品.

1.2 方法。

1.2.1 胃癌细胞及耐药性胃癌细胞的培养 SNU—601/WT胃癌细胞株和SNU—601/cis2耐药性胃癌细胞株分别用含100mL/L FBS的RPMI1640培养液，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中进行培养.

1.2.2 MTT法检测TGF—β1对SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞生长的影响 取对数生长期细胞.将SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞分别接种于平底96孔板中，每孔细胞数为2×10 4 个，每次设空白对照组（调零）、对照组及实验组，每组分别设3个复孔，接种后培养24h，使细胞贴壁生长.向实验组各孔加入10μg/L TGF—β1，分别培养24，48，72，96h后，向每孔加入5g/L MTT试剂10μL，在二氧化碳培养箱中继续培养4h，弃去MTT液，加入150μL DMSO，振荡10min;对照组处理除未给予 TGF—β1外与实验组相同.用酶标仪在540nm波长 测定各组细胞吸光值，按下列公式计算细胞生长率:细胞生长率（%）=实验组吸光值对照组吸光值×100。

1.2.3 免疫细胞化学染色 将1×10 3 个SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞接种于Chamber Slide（Nunc，Inc.2000North Aurora Road Naperville，SNA），在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长.实验组细胞用10μg/L TGF—β1进行处理，对照组只加入培养液，分别培养24，48，72，96h后，弃去培养液，用PBS清洗，100g/L甲醛（pH值为7.0）固定10min，收集标本.免疫细胞化学染色根据ABC试剂盒说明书方法进行.结果判定蛋白表达强度根据阳性物质的着色即阳性细胞数的多少分为3级:每高倍视野阳性细胞数少于10%为阴性（—）;阳性细胞数在10%～50%之间为阳性（+）;阳性细胞数超过50%为强阳 性（）.

1.2.4 统计学处理 采用两样本率比较的卡方检验进行.

2 结果。

2.1 TGF—β1对SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞生长的影响 MTT法检测结果见Table1.由Table1可见，实验组SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞生存率均具有时间依赖性，即随着作用时间的延长，生存率降低，但SNU—601/cis2细胞在72h时出现最低生存率，96h时有所增高.实验组SNU—601/WT，SNU—601/cis2细胞生存率与对照组比较均有显著性差异（P0.01）;实验组SNU—601/cis2，SNU—601/WT细胞生存率之间相比较，在48，72h时具有显著性差异（P0.01，P0.05）. Table1 Effect of TGF—β1in SNU—601/WT and SNU—601/cis2cell growth。

2.2 TGF—β1对SNU—601/WT细胞p16，cyclin D1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果示，对照组中p16蛋白表达在24，48，72，96h时均呈阴性（—），在实验组中24h时呈阳性（+），48，72，96h 时呈强阳性（）;提示TGF—β1可时间依赖性增强。