高迁移率族蛋白1在高容量血液滤过防治MODS中的变化及意义
作者：沈贤，沈淑蓉，薛向阳，林富林，朱冠保，方国恩。
【摘要】 目的:通过观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）在多脏器功能障碍综合征（MODS）发生过程中的变化趋势，探讨MODS发生机制及高容量血液滤过（HVHF）防治MODS的理论依据。方法:采用失血性休克复苏+内毒素血症复合因素建立猪MODS模型，将19只健康雄性家猪随机分成MODS组和HVHF组，HVHF组动物内毒素注射后予血液滤过，血滤采用F50聚砜膜滤器，超滤量3 L/h。Western blot法检测血浆HMGB1蛋白含量变化，并通过与各自基础值的比较，了解HMGB1蛋白相对变化趋势。结果:HVHF组2例发生MODS，占20%（2/10），显著低于MODS组88.9%(8/9) (P0.01)，主要器官功能明显改善。HMGB1蛋白水平于内毒素注射后1 h无明显升高，至24 h两组均显著升高，后呈缓慢下降趋势。HVHF组，HMGB1蛋白相对于基础值水平升高幅度明显低于MODS组。结论:HMGB1蛋白等炎症介质的过度表达是MODS发生的本质原因之一；HVHF能够降低血循环中HMGB1等炎症介质的峰值浓度，有效遏制过度的炎症反应，防止MODS发生。
Abstract: Objective: To explore the pathogenesis of MODS and the role of HVHF in preventing and treating MODS through observing the fluctuation of high mobility group—1 protein (HMGB1). Methods: Double—hit method was used to establish the porcine MODS model. Nineteen healthy male minipigs were randomly divided into MODS group and HVHF group that underwent prophylactic high—volume hemofiltration(3 L/h) after injection of LPS. F50 polysulfone membrane filter was used. Plasma levels of HMGB1 were detected with Western immunoblot analysis,and its tendency was observed through comparing with base level. Results: The mobidity of MODS in group H was 20%（2/10）, much lower than that in group M (88.9%,8/9) (P0.01). Main organ functions were improved by HVHF. And the plasma level of HMGB1 obviously elevated in both group 24 hour after the endotoxin injection, then started to drop slowly. In group H, the peak of HMGB1 protein correspond to base level was lower than that in group M. Conclusion: Excessive release of inflammatory cytokines, including HMGB1 protein is one of the essential pathogenesis of MODS. HVHF can prevent and treat MODS through cutting down the peak value of inflammatory cytokines, including HMGB1 protein, restraining excessive inflammatory responses.
Key words: multiple organ failure; hemofiltration; HMGB1 protein。
高迁移率族蛋白1(high mobility group—1 protein，HMGB1)为新近发现的一种晚期炎症介质[1]，参与了脓毒症所致多器官损害的发病过程。而高容量血液滤过（high volume hemofiltration，HVHF）能通过削弱血循环中炎症介质的峰值浓度，重建机体免疫系统的内稳态，防止多脏器功能障碍综合征（MODS）的发生[2]。本研究试图从HMGB1角度出发探讨MODS的发生机制及HVHF防治MODS的理论依据。
1 资料和方法。
1.1 主要试剂和仪器 F50聚砜膜血液过滤器（德国Fresenius公司产品），鼠抗猪HMGB1单克隆抗体（美国Stressgen公司产品），HRP标记二抗（上海华美生物公司产品），NBT/BCIP显色液（上海华美生物公司产品），硝酸纤维素膜（德国Schleicher Schuell公司产品），Phamacia电泳仪（瑞士Phamacia公司产品）。
1.2 实验动物分组及模型建立 失血性休克复苏+内毒素血症复合因素建立猪MODS模型[3]。体重22～30 kg健康雄性家猪被随机分为2组：MODS组（M组）9只，HVHF组(H组)10只。H组动物内毒素注射后予床边血液滤过，放血前、内毒素注射前、内毒素注射后1 h、24 h、48 h及96 h（处死前）留取血标本。
1.3 HVHF 内毒素注射完毕后开始HVHF，采用BP—21型自弹式血泵、F50聚砜膜滤器(膜面积1.0 m2)，血流量200 ml/min，超滤量根据全天治疗量和生理需要量设定，前稀释法输入。连接前血路管道先用5 000 IU/L的肝素生理盐水循环30 min，肝素以1 500 IU/h持续抗凝。治疗持续时间为12 h，12 h后更换滤器，共3 d。
1.4 Western blot法检测血浆HMGB1蛋白含量变化 T1～T6时间点各取30μl经冷冻抽干浓缩后血浆样本上样进行SDS—PAGE电泳，将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，3%的脱脂奶粉室温封闭30 min后与适当稀释的一抗（鼠抗猪HMGB1单抗）室温反应2 h，漂洗后与适当稀释的第二抗体（羊抗鼠IgG—AP二抗标记）室温反应2 h，BCIP/NBT底物显色。
1.5 图像分析及数据处理 采用Labworks4.6版本UVT明胶扫描软件测定每组样本蛋白表达的灰度值，分别计算出与各自T1时间点的比值，以此反映HMGB1蛋白相对基础值水平的变化趋势。
1.6 统计学处理方法 数据以±s表示，采用SPSS11.5统计软件行统计学处理，两组均数比较采用t检验，MODS的发生情况比较采用Fisher确切概率法检验。