放射与抗VEGF抗体对人肝癌移植瘤生长的抑制作用

作者：郑青平,陈龙华,石玉生。

【摘要】 　　目的 观察放射与抗VEGF单抗对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 SMMC7721肝癌细胞种植于裸鼠后肢皮下,成瘤动物分为放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,单抗每次每只50μg隔日腹腔给药,共6次,放射剂量20Gy一次给予,测肿瘤直径并计算瘤体积。抗体给药结束后2周处死动物,称瘤重,免疫组化法测肿瘤微血管密度。结果 放射和抗VEGF单抗明显抑制肿瘤生长,减少肿瘤微血管密度,但两组之间差异无显著性。放射与抗VEGF单抗联合较单纯放射或抗体抑瘤作用显著,三组瘤重抑制率分别为89.2%、75.3%和65.9%,差异有显著性。结论 放射结合抗VEGF单抗显著抑制肝癌移植瘤生长,是肝癌综合治疗的有效途径。

【关键词】 肝肿瘤　放射疗法　抗VEGF单抗;裸鼠。

The Inhibiting Effect of Radiation and AntiVEGF Monoclonal Antibody on the Growth of Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts。

Key words：Hepatocellular carcinoma;Radiotherapy;AntiVEGF mAb;Nude mice。

肝癌是放射不敏感肿瘤,而肝脏对放射线较敏感,常规放射治疗的疗效不满意[1]。肿瘤血管形成对肿瘤生长及转移起着关键性作用,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是肿瘤血管形成的关键因子,抗血管形成可抑制肿瘤生长。肝癌是富血管肿瘤,抗血管形成治疗能抑制肝癌裸鼠移植瘤生长[2]。本文结合放射与抗血管形成治疗,观察两者对肝癌移植瘤生长的协同抑制作用。

1材料与方法。

1.1材料。

实验动物 BALB/cnu/nu小鼠22只,购自南方医科大学实验动物中心,5～6周龄,雄性,体重19.0～22.0g,SPF层流柜分笼饲养。SMMC7721人肝癌细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。抗VEGF单抗，克隆号26503.11购自Sigma公司。

其他主要仪器和试剂：培养箱（37℃、5%CO2）,Varian 23EX医用直线加速器（美国）,RPMI1640细胞培养液（含10%胎牛血清、青链双抗各100u/mg、100μg/ml）、胰酶,免疫组化SABC法相关试剂购自武汉博士德公司。

1.2方法。

细胞繁殖传代,取指数生长期细胞胰酶消化，2 000r/s离心2min,收集细胞用0.9%生理盐水悬浮,显微镜下计数细胞浓度,生理盐水定容至2×107/ml。

参考文献方法[3],裸鼠于饲养环境适应1d后种植,取裸鼠右后肢大腿外侧皮下为种植点,1ml注射器抽取0.2ml细胞悬液（含4×106个细胞）注入种植点皮下。

肿瘤种植后1周,形成明显皮下肿块,种瘤后10d肿块直径约5mm。有1只动物未成瘤,1只动物成瘤直径2mm,此2只动物舍去。其余20只动物按随机原则分为,放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,每组动物5只。用游标卡尺测量肿块长径a及横径b,隔日测量1次,体积公式V=a×b2/2。

无菌PBS液溶解抗体至100μg/ml,种瘤后10d分组后腹腔注射给药,抗体量50μg/只,隔日1次,共6次,无抗体组同样途径给予等体积量PBS。第4次注射抗体后24h放射治疗,放疗机房紫外线消毒,受照动物四肢以细绳固定在小木板上,照射野大小3×3cm,源皮距100cm,6MeV电子线,剂量率4Gy/min,总剂量20Gy一次性给予。

种瘤后34d处死动物,分离肿块周边皮肤及非肿瘤组织,天平称重,瘤重抑制率=（1实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。

1.3免疫组化微血管密度(MVD)测定。

肿瘤组织10%甲醛固定24h,脱水石蜡包埋,切片厚5μm,免疫组化SABC法:一抗为多克隆兔抗鼠CD34,工作液1∶100稀释。即用型SABC免疫组化试剂盒,具体操作按试剂盒说明进行,DAB染色,苏木素复染,树胶封片。选细胞染色密集区高倍镜(×200)计数染色细胞,每片计数5个野取平均值。

1.4统计学处理。

SPSS10.0统计分析软件,应用重复测量数据方差分析和多个独立样本非参数检验法处理数据,Ｐ＜0.05为统计学差异有显著性。