苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠STAT3信号分子的影响
【摘要】 目的: 动态观察苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3变化的影响,探讨苦参碱在肾脏纤维化发病进程中的作用及其机制. 方法: 45只健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组及试验组各15只,用单侧肾切除加1 wk后尾静脉注射阿霉素(5 mg/kg)的方法建立肾小球硬化大鼠模型,为模型组;只行手术不注射阿霉素为对照组;造模后即予苦参碱100 mg/(kg·d)灌胃干预治疗为试验组. 于2,4,6 wk分批处死每组各5只大鼠,采用免疫组化检测肾脏STAT3、转化生长因子β1(TGFβ1)表达,实时荧光定量PCR技术观察STAT3,PIAS3 mRNA表达. 结果: 第6 wk时,模型组肾小球硬化指数(71.7±11.2)%高于对照组(17.6±2.5)%及试验组(44.9±8.9)% (P0.01);模型组TGFβ1在肾皮质表达(2.196±0.394)%多于对照组(0.017±0.005)%及试验组(0.750±0.089)% (P0.01),并呈逐渐升高趋势;模型组STAT3蛋白(19.58±2.66)%表达较对照组(7.64±1.25)%增高(P0.01),试验组(14.90±1.66)%较模型组(19.58±2.66)%降低(P0.01);模型组STAT3 mRNA表达为5.06±0.26倍于对照组,高于试验组的3.49±0.39倍(P0.01),而PIAS3 mRNA呈相反趋势. 结论: 苦参碱有抑制肾小球硬化进展的作用,其作用机制可能为下调JAK/STAT通路信号分子STAT3及上调其抑制分子PIAS3的表达,降低TGFβ1的蛋白水平,从而延缓肾小球硬化进程.
【关键词】 苦参碱;肾小球硬化症,病灶性;JAK/STAT信号转导通路;STAT3信号分子;大鼠;多柔比星。
【Abstract】 AIM: To dynamically observe the effect of matrine on STAT3 and PIAS3 in adriamycininduced glomerulosclerosis in rats and explore its protective mechanisms. METHODS: Fourtyfive male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: model group, control group and experimental group(n=15 in each group). Adriamycin nephropathy was induced by complete excision of left kidney and a single tail intravenous injection of adriamycin(5 mg/kg); control group received only the operation but without intravenous injection of adriamycin; experimental group were treated with matrine 100 mg/kg·d after accomplishment of adriamycin nephropathy. Five rats in each group were sacrificed every 2 weeks. A semiquantitative score was used to evaluate the degree of glomerular lesions. Immunohistochemistry was employed to examine the expression of STAT3 and transforming growth factorβ1 (TGFβ1). Finally,the expressions of STAT3 and PIAS3 mRNA were measured by realtime quantitative RTPCR. RESULTS: Glomerulosclerosis index (GSI) in model group increased progressively(71.7±11.2)%, and was higher than that of control group(17.6±2.5)% and experimental group(44.9±8.9)% at week 6; Immunohistochemical staining indicated that STAT3 and TGFβ1 expressions gradually increased in model group[TGFβ1(2.196±0.394)%; STAT3(19.58±2.66)] and were higher than those in control group[TGFβ1 (0.017±0.005)%; STAT3(7.64±1.25)%] and experimental group [TGFβ1(10.750±0.089)%; STAT3(14.90±1.66)%]at week 6. The expression of STAT3 gene in model group was increased compared with the control group (5.06±0.26 times higher than that of control group) and experimental group (3.49±0.39 times higher than that of experimental group), and PIAS3 mRNA expression change displayed an opposite tendency. CONCLUSION: Matrine has a depressive role in the development of glomerular sclerosis in adriamycininduced nephropathy rats. Its mechanism is considered to be related to intervention of the pathway of signal conduction of JAK/STAT: Upregulation of PIAS3, downregulation of STAT3, and decrease of TGFβ1 protein.
【Keywords】 matrine; glomerulosclerosis, focal; pathway of signal transduction of JAK/STAT; STAT3 signaling molecule;rats, doxorubicin。
0 引言 近年来研究发现,苦参碱(matrine)具有抑制成纤维细胞及胶原合成,防治实验性大鼠肝纤维化的作用. 但其对肾小球硬化作用及机制目前尚未完全明晰;信号转导子与转录激活因子(STAT)作为JAK的靶蛋白,是存在于细胞胞质中的一个转录因子家族,STAT3是该家族的重要成员. 研究表明STAT3途径不仅是参与肾脏疾病发病过程中一个很重要的信号转导途径,而且与多种增生性肾小球疾病的发生有关[1—2]. 本研究通过免疫组化及实时荧光定量PCR等方法,观察阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠模型及苦参碱干预治疗后肾组织STAT3、转化生长因子β1(TGFβ1)蛋白表达和STAT3,PAS3 mRNA表达,探讨苦参碱在肾小球硬化治疗作用及机制,为临床防治肾小球硬化寻找新的途径.
1 材料和方法。
1.1 材料 纯系健康Wistar大鼠45只,雄性,体质量(200±20) g,8~9周龄,普通级,兰州大学中心实验室动物中心提供(医动字第07371号). 苦参碱(宁夏紫荆花药业股份有限公司,批号20070329);阿霉素(深圳万乐药业有限公司产品, 批号:0703E2);Trizol(上海生工生物工程技术服务有限公司);Taq DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、Oligo d(T)18,dNTP,DNA Marker,SYBR Premix Ex TaqTM(大连TaKaRa生物工程公司);DEPC(上海实生细胞生物技术有限公司,为进口分装分析纯);STAT3,PIAS3,内参照GAPDH的引物由大连TaKaRa生物工程公司合成;STAT3,TGFβ1兔抗大鼠mAb(武汉博士德生物工程公司);免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、羊抗鼠FITCIgG二抗作液(北京中杉金桥生物工程公司).
1.2 方法。
1.2.1 模型制备及分组 大鼠给予普通饲料、自由饮水适应性饲养1 wk,随机分为3组: 对照组、模型组及试验组,每组各15只. 造模方法参照文献[3]采用单侧肾切除加单次阿霉素(5 mg/kg)尾静脉注射制作大鼠肾小球硬化模型;对照组行假手术,尾静脉注射等量蒸馏水. 从第1次注射阿霉素后开始干预治疗, 试验组给予苦参碱100 mg/(kg·d)灌胃,模型组和对照组每日给予等容积蒸馏水灌胃. 实验周期共6 wk.
1.2.2 标本制备 于实验第2,4,6 wk分批处死大鼠每组5只,迅速摘除左肾,将1/2肾组织置40 g/L多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋,制备肾组织HE,Masson染色和免疫组化标本,另1/2肾组织放入DEPC处理的冻存管,液氮保存,留待荧光定量PCR检测.
1.2.3 指标检测 (1)肾组织病理检查: 肾组织病变程度采用Raij[4]半定量积分法评估肾小球硬化程度,每张切片观察40个肾小球,然后计算肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index,GSI). 每张切片肾小球平均硬化指数计算公式为:[(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/40]×100%,式中N1代表1级损害肾小球个数,N4为4级损害肾小球个数. (2)肾组织STAT3,TGFβ1蛋白表达的检测: 采用免疫组化SP法检测,将石蜡包埋的肾组织标本,4 μm厚切片,方法与步骤严格按说明书操作,一抗STAT3,TGFβ1,稀释倍数1∶100,并设阴性对照,以PBS代替一抗,DAB显色,苏木素复染,以光镜下细胞质出现棕黄色颗粒为阳性信号. 结果采用计算机图像分析系统进行半定量分析,每张切片按顺序选10个视野,按阳性染色面积所占视野百分比进行半定量评分后取均值. (3)STAT3,PIAS3 mRNA表达的检测:引物序列设计:内参照GAPDH正义引物、反义引物序列分别为5′GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3′,5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′,产物为143 bp;STAT3 正义引物、反义引物序列分别为5′CACAACCTGCGAAGAATCAAG3′,5′GCTGCTTCTCCGTCACTAC3′,产物为139 bp;PIAS3正义引物、反义引物序列分别为5′GTCGTCCAATCAACATCACAC3′,5′CTCACCAGGTACACAGACAAG3′,产物为118 bp. 经Blast分析引物与大鼠其他基因无同源序列. Trizol法提取细胞总RNA,取2 μg总RNA标本,采用两步法进行PCR: 第一步,利用反转录酶PrimeScriptTM RTase将RNA反转录成cDNA,反应体积为20 μL,反应体系如下: PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I,Oligo dT Primer,Random Primers各1 μL,5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL, RNase Free dH2O 11 μL,反应条件: 42℃ 15 min, 85℃ 5 s;第二步,Real Time PCR反应:在RotorGene 3000 荧光实时定量PCR仪(Corbett Research公司)上进行反应,反应体积为25 μL,反应体系如下: SYBRPremix Ex TaqTM(2×)12.5 μL,PCR Forward Primer,PCR Reverse Primer各0.5 μL,RT反应液2 μL,dH2O 9.5 μL. 反应条件:预变性:95℃ 10 s,1个循环;PCR反应:95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环. 通过荧光融解曲线检测各扩增产物的特异性,证明各扩增产物为特异性目的基因(图1 融解曲线峰值分别重合于84℃和85℃,无引物二聚体峰及非特异性峰产生). 由荧光曲线上读出CT值,以GAPDH为内参照,用2 ΔΔCT法[5,6]计算STAT3,PIAS3 mRNA的相对表达量. 用公式表达如下:ΔΔCT =各组(CT检测指标 CTGAPDH) 对照组(CT检测指标 CTGAPDH),各组基因表达量/对照组基因表达量= 2ΔΔCT.