响应面法对烟草中非挥发性有机酸含量的技术发展
烟草中非挥发性有机酸主要包括多元酸和高级脂肪酸，占烟叶重量的10%左右，可调节烟叶自身的酸碱度，影响烟叶的劲头和吃味，起到平衡烟气的作用，也能影响烟气的香气[1，2]。
国内已有关于酯化试验单因素对烟草中非挥发性有机酸测定结果影响的相关报道[3—5]，但未见采用响应面法优化设计烟草非挥发性有机酸的测定条件。
响应面法（RSM）根据Box—Behnken Design（BBD）设计的试验结果进行二次多元回归拟合，分析因素与响应值的关系，达到优化试验条件的目的[6—8]，该方法已广泛应用于化学、生物、食品等领域。
本研究以烟草中非挥发性有机酸总量为指标，采用响应面法优化烟草非挥发性有机酸的测定条件，以期为卷烟工业的加工利用提供科学的参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器 烟叶由红塔辽宁烟草有限责任公司提供。
硫酸（优级纯，天津市四友精细化学品有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；己二酸二甲酯、草酸二甲酯、丙二酸二甲酯、丁二酸二甲酯、正十三碳酸甲酯、苹果酸二甲酯、硬脂酸甲酯、正十五碳酸甲酯、月桂酸甲酯、柠檬酸甲酯 （分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；棕榈酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯（百灵威科技有限公司）；二氯甲烷、无水硫酸钠、氯化钠（分析纯，天津德恩化学试剂有限公司）。
EL204型电子天平（梅特勒—托利多上海有限公司）；7820A型气相色谱仪（美国安捷伦公司）；HH—4型数显恒温水浴锅（金坛市科学仪器有限公司）。
1.2 方法 1.2.1 烟叶样品的制备 按照我国烟草行业标准[9]制备烟叶样品及测定其含水率。
将烟叶用粉碎机粉碎，过40目筛[(专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]后置于棕色广口瓶中保存，用烘箱法测定含水率。
1.2.2 H2SO4—CH3OH溶液 在冰水浴搅拌的条件下，将适量浓硫酸缓慢加入一定量的无水甲醇中，搅拌均匀配置成不同体积分数的H2SO4—CH3OH溶液。
1.2.3 内标溶液 称量1.493 1 g己二酸二甲酯于250 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，即得到浓度为5.972 mg/mL的内标溶液（0 ℃冰箱内可保存1个月）。
1.2.4 烟叶样品的甲酯化 准确称取1.000 0 g样品，置于100 mL平底烧瓶中，加入一定体积的硫酸—甲醇溶液，再加入1 mL己二酸内标溶，水浴加热，取回流液10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL饱和氯化钠溶液，每次用10 mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，加入3.0 g无水硫酸钠干燥过夜。
采用气相色谱法进行测定。
1.3 气相色谱分析条件 气相色谱条件：色谱柱为HP—INNOWAX（30 m0.25 mm0.25 m）；载气为氦气；柱流速1.2 mL/min （恒流模式）；平均线速度29.134 cm/sec；进样口温度280 ℃；分流比为5∶1；程序升温，色谱柱初始温度50 ℃（保持2 min），以4 ℃/min升温至220 ℃（保持20 min）；进样量为1.0 L。
检测器为FID；检测器温度为280 ℃；氢气为40 mL/min；空气为450 mL/min；尾吹气为20 mL/min。
1.4 非挥发性有机酸定性、定量方法 与标准样品相对保留时间比较，对各非挥发性有机酸定性，采用内标法定量。
2 结果与分析 2.1 工作曲线 称取适量非挥发性有机酸甲酯标准样品于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制7个梯度的标准溶液进行气相色谱分析，并对各标准样品与内标的峰面积之比与相应标样的质量进行回归分析。
得到各非挥发性有机酸甲酯线性方程及相关系数，各成分的相关系数为0.997～0.999，表明工作曲线线性关系良好，适用于非挥发性有机酸的定量分析。
2.2 甲酯化反应的单因素试验 2.2.1 不同体积分数的H2SO4—CH3OH溶液对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别使用2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%的H2SO4—CH3OH溶液进行考察，结果如图1所示。
由图1可知，随着H2SO4—CH3OH溶液体积分数的增加，非挥发性有机酸总量也增加，当浓度达到10%时非挥发性有机酸总量最大，之后有所下降。
主要原因是在高浓度硫酸环境中，非挥发性有机酸会发生脱水和氧化反应，导致测定结果偏低。
2.2.2 料液比对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别使用25、30、35、40、45、50和55 mL 12%的H2SO4—CH3OH溶液进行试验，结果如图2所示。
由图2可知，随着H2SO4—CH3OH溶液体积的增加，非挥发性有机酸总量测定值也随之增加，当料液比达到1∶45时，非挥发性有机酸总量的测定值最大，所以较合适的料液比为1∶45。
2.2.3 水浴温度对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别取水浴温度60、70、80、90、100 ℃进行试验，结果如图3所示。
由图3可知，随着水浴温度的升高，非挥发性有机酸的测定值也增加，当温度达到90 ℃时测定值接近达到最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。
主要原因是随着温度的增加加快了酯化反应，但是温度过高会导致衍生物挥发和分解，导致测定结果偏低， 选取最佳水溶液温度为92 ℃。
2.2.4 回流时间对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别选取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h进行试验，结果如图4所示。
由图4所知，随着回流时间的增加，非挥发性有机酸的测定值也增加，当达到3 h时测定值达到最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。
主要原因是因为反应时间过长高级脂肪酸会破坏，导致测定值偏低。
2.2.5 CH2Cl2萃取次数对测定结果的影响 保持其他因素不变，对回流液用CH2Cl2萃取1、2、3、4、5、6次，结果如图5所示。
由图5可知，随着萃取次数的增加，非挥发性有机酸的测定值也增加，甲酯化衍生物得到充分萃取，当萃取5次时测定值最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。
2.3 响应面分析法优化工艺条件 2.3.1 响应面分析方案与试验结果 根据单因素试验的结果，以A—H2SO4—CH3OH溶液的体积分数、B—料液比、C—水浴温度、D—回流时间为考察因素，采用Design—Expert软件为辅助手段设计响应面试验，响应面各因素及水平如表1所示，采用Box—Behnken 设计进行了29组试验。
2.3.2 方差分析和二元回归方程拟合 采用Design—Expert软件对29组试验结果进行二次多元回归拟合，得到非挥发性有机酸的测定值的。