氯化两面针碱的体外肾毒性研究
【摘要】 目的观察氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作用。方法采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱对人胚肾细胞293的毒性。结果氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293有一定的毒性作用。结论氯化两面针碱可抑制人胚肾细胞293的增殖，对肾脏有一定的毒性。
【关键词】 氯化两面针碱; 人胚肾细胞293; 体外肾毒性。
Abstract：ObjectiveTo detect the toxicity of nitidine chloride in human kidney cell 293 in vitro.MethodsCell proliferation was assayed by MTT method.ResultsNitidine chloride inhibited the proliferation of human cell 293 in a dose—dependent manner.ConclusionNitidine chloride has the function of inhibiting proliferation on the kidney cell 293.
Key words：Nitidine chloride; Human kidney cell 293; Kidney toxicity; In vitro。
中药抗肿瘤是目前医学界研究的一个热点，很多中药成分被证实具有较好的抗肿瘤效果而得以逐步走向临床。氯化两面针碱是两面针制剂的主要有效成分，在抗炎、镇痛、抗肿瘤、心血管系统等方面的作用已有较多报道。氯化两面针碱有较强的抗癌作用，据文献[1]报道，氯化两面针碱对LEWIS肺癌、鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病均有抑制作用，对小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效，而其对肾的毒性问题未见报道,特别是在细胞水平、分子水平都未见报道。作为一个新型的抗肿瘤药物，其肾毒性大小至关重要。本实验中，我们考察了氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作用。
1 材料与仪器。
1.1 试药氯化两面针碱标准品(中国药品生物制品检定所);四噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);DMEM(美国GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所公司);胰蛋白酶(美国Amresco公司公司);谷氨酰胺(美国Amresco公司);PBS(美国Amresco公司);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司);注射用硫酸链霉素(大连美罗大药厂);HEPES(Sigma公司)。
1.2 仪器二氧化碳培养箱(美国Forma Scientific公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(芬兰thermo公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96孔培养板(美国BIO—RAD公司);6孔培养板(美国BIO—RAD公司);超净工作台(苏州净化设备厂);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)。
1.3 细胞株人胚肾细胞293细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)。
2 方法。
2.1 DMEM培养液的配置DMEM培养干粉以1 000 ml三蒸水充分溶解，加入NaHCO3 2.0 g, HEPES 4.766 g，加入青霉素、链霉素使其终浓度为100 U·ml—1， 在超净工作台中过虑除菌，分装成90 ml/瓶，—20℃保存备用，临用前加10 ml热灭活(56℃，30 min)胎牛血清。
2.2 梯度氯化两面针碱的制备精密称定氯化两面针碱标准品适量用DMSO溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成0.781 25，1.562 5，3.125，6.25，12.5 μg/ml浓度梯度的氯化两面针碱系列浓度样品，置于4℃冰箱中保存备用。
2.3 细胞培养人正常胚肾细胞293分别培养于含DMEM完全培养液的玻璃培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，定期观察更换培养液。细胞铺满培养瓶底部时传代，用PBS冲洗两次，加入0.25%胰蛋白酶 2 ml消化液，置37℃约1 min，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失，表明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液2 ml，反复吹打，将细胞吹打均匀，调整培养瓶中细胞浓度至1×105/ml,加入完全培养液，置于CO2的培养箱。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。
2.4 氯化两面针碱的肾毒性实验(MTT法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入96孔培养板，每孔190 μl，在5%CO2、37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，受试孔加入系列浓度受试药物10 μl每药3孔，阴性对照孔加入含0.5%DMSO的无血清培养基10 μl，空白对照孔加入等量的含药无血清培养基而无细胞，各孔加培养基至200 μl，培养箱孵育24，48，72 h，加入5 mg/ml的MTT10 μl，继续在培养箱培养4 h，取出96孔板顷去上清液，加入DMSO每孔150 μl，在摇床上振动摇匀10 min，在酶标仪570 nm和630 nm的波长下测得各孔OD值。按下式计算药物对293细胞的抑制率。
抑制率(%)=对照组OD值—实验组OD值对照组OD值×100%。
实验重复3次，计算平均抑制率。
2.5 SOD，MDA，LDH的测定(紫外分光光度法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9 ml，在5%CO2，37℃培养箱培养24h待细胞完全贴壁后，实验孔加入3.125 μg/ml氯化两面针碱0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48 h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中所述方法进行SOD，MDA，LDH的测定。