微生物限度 [头孢卡品酯胶囊微生物限度检查方法验证试验研究]
[摘要] 按照《国药》005年版二部微生物限检方法进行验证试验,建立头孢卡品酯胶囊微生物限检方法。
该药细菌计数方法薄膜滤法;霉菌及酵母菌计数方法平皿法;控制菌(肠埃希菌)计数方法薄膜滤法和培养基稀释法。
[关键词] 头孢卡品酯胶囊; 薄膜滤法; 平皿法; 培养基稀释法。
[图分类] R978+ [献标识码] [编] 673970(00)3860。
头孢卡品酯胶囊是由头孢卡品酯和辅组成胶囊剂,四代口头孢类抗生素。
具有广谱抗菌活性,对耐青霉素(含等程耐药)肺炎链球菌活性很强,对很多耐抗生素病原菌有良疗效。
试验用005年版国药规定3株细菌(肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)、株真菌(黑曲霉、白色念珠菌)[]对三批头孢卡品酯胶囊进行了微生物限检法验证试验,以确认所采用方法是否适合该药品细菌、霉菌、酵母菌数测定和控制菌检及检药品身污染微生物状况,结报道如下。
实验材。
仪器。
000型集菌仪、泵管330型(批00806)、K型培养器专用震荡仪、反复使用集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司);LR50生化培养箱(上海普仪器有限公司)。
试药。
营养琼脂培养基(批079)、营养肉汤培养基(批079)、玫瑰红钠琼脂培养基(批077)、BL培养基(批070)、G培养基(批08076)北京三药科技开发公司;靛基质试验欧波试液(批080730)江苏宜兴永信生物有限公司;09%无菌氯化钠溶液、 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(扬子江药业集团有限公司输液车配制)。
3 菌种。
肠埃希菌[(B)0];金黄色葡萄球菌[(B)6003];枯草芽孢杆菌[(B)6350];黑曲霉[()98003];白色念珠菌[()9800]由国药品生物制品检定所提供。
方法。
菌液制备[]。
分别接种肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基30～35℃培养8～;接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁培养基3～8℃培养～8,上述培养物用09%无菌氯化钠溶液稀释成含菌数(50～00)L菌悬液;另外接种黑曲霉新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基,3～8℃培养5,加入5L 09%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,用09%无菌氯化钠溶液稀释成含孢子数(50～00)L菌悬液,备用。
供试液制备。
供试液取供试品5g,加入已灭菌吐温80约5L,慢慢加入5℃ 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至00L,边加边搅拌,保温振摇使混匀,静置上清液作∶0供试液。
稀释剂对照液分别取灭菌吐温80约5L,分别加入约5000～0000菌悬液,慢慢加入5℃70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至00L,边加边搅拌,使混匀,作含菌量(50～00)L稀释剂对照液。
各试验菌分别制备份。
3 细菌、霉菌及酵母菌常规法计数方法。
3 试验组 取 ∶0 供试液L,每毫升供试液和(50～00)L试验菌加入平皿,立即倾相应规定培养基,每株试验菌平行制备平皿,按平皿法测定菌落数。
3 菌液组 分别取各备用试验菌,加入与试验组等量菌液,测定每菌株所加试验菌数。
33 供试品对照组 方法试验组,不加试验菌,测定供试品底菌数。
3 稀释剂对照组 取稀释剂对照液代替供试品,按试验组方法操作,以考察供试液制备程微生物受影响程。
35 菌回收率计算 试验组回收率(试验组平菌落数供试品对照组平菌落数)(菌液组平菌落数)×00%;稀释剂对照组回收率(稀释剂对照组平菌落数供试品对照组平菌落数)(菌液组平菌落数)×00%。
试验组 取供试液L,至含有70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液约00L滤筒,振摇滤,用5℃ 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液振荡冲洗,每次50L,冲洗量分别300L、00L、500L,次冲洗液加入(50～00)L菌悬液。
滤取出滤膜,菌面朝上,贴营养琼脂培养基上,30～35℃倒置培养,以8计菌落数,各制备平皿。
菌液组 分别取各备用试验菌各L,入平皿,立即倾营养琼脂培养基约5～0L,混匀凝固,30～35℃倒置培养,以8计菌落数。
各平行制备平皿。
5 控制菌检方法。
5 常规法。
5 试验组 取供试液0L,肠埃希菌菌悬液L,置50L锥形瓶,加入约00L胆盐乳糖增菌培养基,35～37℃培养8～。
5 阴性菌对照组 方法试验组,用金黄色葡萄球菌代替肠埃希菌,依法测定。
5 薄膜滤法。
5 试验组 取供试液0L,至50L 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,振摇滤,然用5℃ 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液振荡冲洗,每次50L,冲洗量300L,次冲洗液加入(50～00)L肠埃希菌菌悬液L,滤取出滤膜,置50L锥形瓶,加入约00L胆盐乳糖增菌培养基,35～37℃培养8～。
5 阴性菌对照组 方法试验组,用金黄色葡萄球菌代替肠埃希菌,依法测定。
53 试验组 取供试液0L,至50L 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,振摇滤,然用5℃ 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液振荡冲洗,每次50L,冲洗量300L,次冲洗液加入(50～00)L肠埃希菌菌悬液L,滤取出滤膜,置50L锥形瓶,加入约00L胆盐乳糖增菌培养基,35～37℃培养8～。
53 阴性菌对照组 方法试验组,用金黄色葡萄球菌代替肠埃希菌,依法测定。
3 结。
3 细菌、霉菌及酵母菌常规法计数方法验证。
见表。
从表结可以看出,霉菌及酵母菌回收率>70%,可采用平皿法;三株细菌回收率70%,由说明该供试品有很强抑制细菌作用,应重新选择细菌计数方法验证。
见表。
从表可以看出,采用薄膜滤法检验头孢卡品酯胶囊,冲洗量300L膜,稀释剂对照组、试验组菌回收率高70%,合验证要,说明薄膜滤可以消除头孢卡品酯胶囊抑制细菌活性,因头孢卡品酯胶囊细菌数测定可采用薄膜滤法测定。
33 控制菌检方法验证结。
见表3。
从表3可以看出,控制菌(肠埃希菌)采用薄膜滤法和培养基稀释法检结合规定。
结论。
通对品进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证,可以确认采用平皿法适用头孢卡品酯胶囊霉菌及酵母菌测定;采用薄膜滤法适用头孢卡品酯胶囊细菌测定。
通对品控制菌检方法验证认,头孢卡品酯胶囊肠埃希菌检采用薄膜滤和培养基稀释法检。
[参考献]。
[] 国药委员会编 华人民共和国药(二部)[] 北京化学工业出版社,005附录6。
[] 国生物制品检定所编 国药品检验标准操作规[] 北京医药科技出版社,0053353。