糖基转移酶2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达

作者：洪文荣 曾志红 朱春宝 陈代杰 朱宝泉。

【摘要】 从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD(1181bp)，并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa(43.04ku)的多肽链，在大肠埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD(来自M.echinospora)的碱基序列的同源性高达94%。预测的SilD蛋白序列与GntD的同源性为98%。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srm1(AY661430)、西索米星2脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)和糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

【关键词】 糖基转移酶2基因； 伊纽小单孢菌； silD； 克隆与表达 论文网。

ABSTRACT The gene silD, a novel glycosyl transferase2 gene, was cloned in our laboratory. The DNA fragment containing silD (1185bp) gene (the key gene involved in sisomicin biosynthesis) was isolated from Micromonospora inyoensis and cloned into pUC18 vector. Its ORF is composed of 1,173 bp, encoding 390aa (43.04ku). Sequence analysis verified that silD gene and amino acids sequence showed 94% and 98% identity with gntD (glycosyltransferase gene for gentamicin biosynthesis from M.echinospora), respectively. The prediction of structure of silD suggested it is also a glycosyl transferase protEin. The silD expression vector pETsilD was constructed by fusion of the flanking silD ORF in the pET30a plasmid. The silD protEIn was expressed by IPTG induction in E.coli BL21(DE3):: pETsilD. The successful expression of silD in the E.coli BL21(DE3):: pETsilD will facilitate the further function analysis of the novel gene silD in Micromonospora inyoensis. The silD is a novel gene after cloning the sisomicin resistance gene srm1, glycosyl transferase gene sisZ and 2deoxy scyllo inosose synthase gene sisB from Micromonospora inyoensis.

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KEY WORDS Glycosyl transferase2 gene; Micromonospora inyoensis; silD; Clone and expression。

放线菌中的小单孢菌属微生物能产生重要的氨基糖苷类抗生素，而氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物。伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)产生的西索米星及其相关的衍生物奈替米星被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素中不良反应最少、抗铜绿假单胞菌作用最强、抗钝化酶能力最广的抗生素，世界卫生组织(WHO)将奈替米星列为对人类健康极其重要的抗感染药物。 论文代写。

西索米星生物合成途径还未在基因组水平上得到深入研究。采用突变阻断试验，并对突变合成和代谢途径中的中间体进行分析，结果表明西索米星存在复杂的生物合成机制，至少需要连续七步酶促反应步骤，估计参与西索米星生物合成的酶基因有几十个，因为庆大霉素生物合成基因簇总共由30个基因组成［1］。考虑到这些微生物及其药物的重要性，揭开它们生物合成基因簇的排列方式和调节机制是非常有意义的。

近十多年，已从几株重要的产抗生素小单孢菌中克隆到几个氨基糖苷类抗生素抗性基因，如从绛红小单孢菌和玫瑰小单孢菌中分离到庆大霉素抗性基因grmA和grmB，从兹昂小单孢菌克隆到sgm，从伊纽小单孢菌中分离到sisA等［2～5］。随着对小单孢菌抗性基因研究的不断取得进展［6］，对这类小单孢菌生物合成基因簇的研究也进入了高潮，而且对产同一种抗生素的不同产生菌的基因簇都同时得到了研究，如产庆大霉素的绛红色小单孢菌基因簇［7］和棘孢小单孢菌的基因簇［1，6］。产氨基糖苷类抗生素的其它产生菌同样受得了高度重视，如产卡那霉素的卡那霉素链霉菌的生物合成基因簇［8］、产妥布霉素的黑暗链霉菌的基因簇［9，10］，产核糖霉素的核糖苷链霉菌的基因簇［11］等。目前国内、外对依纽小单孢菌基因簇的研究报道得不多，而西索米星又是一个对人类健康极其重要的抗生素，因此克隆研究参与西索米星生物合成基因及其基因组的排列和调控机制等非常必要。

本研究继从依纽小单孢菌克隆到西索米星抗性基因srm1(AY661430)、西索米星糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)和蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)后，又从依纽小单孢菌克隆到一个参与西索米星生物合成的基因——糖基转移酶2基因silD(GenBank登记号为DQ250992)。本文报道糖基转移酶基因2 silD的克隆表达及其核苷酸、氨基酸序列等。

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1 材料和方法 毕业论文。

1.1 材科。

毕业论文。

1.1.1 菌种与质粒 伊纽小单孢菌(M.inyoensis)TS388由福州大学提供；大肠埃希菌BL21(DE3)、大肠埃希菌DH5a和质粒pUC18均由上海来益生物药物研发中心提供；表达载体为pET30a购自Novagen公司。其它常用化学药品及试剂购自上海生物工程公司和华美公司。 代写论文。

1.1.2 培养基 LB培养基［12］根据需要添加氨苄西林(终浓度100mg/ml)和卡那霉素(终浓度50μg/ml)；用于伊纽小单孢菌TS388生长的培养基见 文献 ［13］。

1.1.3 主要试剂 所有工具酶购自TaKaRa公司；氨苄西林(ABPC)和卡那霉素为华美生物工程公司产品；琼脂糖为Pharmacia产品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司测定。

代写论文。

1.2 DNA操作和基因silD克隆及其测序 代写论文。

伊纽小单孢菌TS388染色体DNA的提取参照文献［13］；质粒DNA采用碱裂解法提取［12］，DNA酶切、连接等均按产品说明书进行；采用CaCl2方法制备感受态细胞，在含有抗生素的选择性培养基上筛选阳性转化子。DNA采用试剂盒回收(购自TaKaRa公司)。

从GenBank中选择与伊纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的庆大霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gntD作为引物设计的 参考 模板(AY524043)，设计一对简并引物，正向引物为：GAGAATTCATGGGCGGCATGCACGT(EcoRI)；反向引物为：ACCTGCAGCGGTCATCTCAGGACTC(PstI)。PCR循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，64℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃保温10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，克隆到pUC18载体上，阳性克隆子被命名为pLYsilD，并送TaKaRa公司测序，所得序列应用vector NTI 9.1和Blast软件进行序列比对和结构预测。

1.3 融合蛋白表达载体的构建及分析 论文代写。

提取阳性克隆子pLYsilD和pET30a质粒，分别经EcoRIHindIII双酶切，分离回收silD片段和pET30a载体，经酶切连接、转化，挑单个阳性克隆(大肠埃希菌BL21::pETsilD)到添加卡那霉素的LB培养基中，取1ml菌液加入到含50ml的LB中，培养到A600为0.6～0.8后加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导0～4h，取50μl菌液，加2×SDS蛋白上样缓冲液混合，沸水中煮沸5min，冰上放置5min，然后于15000r/min离心1min，沉淀收集到管底，取上层样品液20μl进行SDSPAGE电泳检测。 论文代写。

2 结果与讨论。

2.1 重组子的构建和克隆 论文网。

引物设计策略。从GenBank基因库查找已公布的有关抗生素生物合成的相关基因或基因簇，经比较后选择与依纽小单孢菌亲缘关系比较接近的、产庆大霉素的棘孢小单孢菌的庆大霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶基因gntD作为引物设计的参考模板，设计简并引物(1.2)，通过改变PCR复性温度，得到了目的片段(1181bp)，命名为silD。silD的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见Fig.1。

毕业论文。

设计了不同的复性温度梯度进行PCR尝试，找到了适合扩增目标片段的合理温度为64℃～68℃(Fig.1中Lane 4～6)，不加exTaq酶作对照。

论文代写。

从Fig.1可以看出，采用该策略设计的简并引物， Lane 1: DL2000 marker; Lane 2～8: the PCRproducts;。

Lane 2 60.0℃, Lane 3 61.6℃, Lane 4 64.1℃, Lane 5 65.5℃, 论文代写。

Lane 7 68.1℃; Lane 8: the PCRproducts (without exTaq, 论文代写。

control, 65.0℃); Lane 9: λDNA/HindIII marker 论文代写。

Fig.1 The electrophoresis of PCRproducts from 论文网。

genomicDNA of Micromonospora inyoensis。

经PCR扩增，得到了比较理想的单一条带(1181bp)，说明该简并引物的设计策略和探索的扩增条件是合理可行的。

PCR扩增获得的DNA(silD)片段经琼脂糖凝胶电泳分离，回收，经相应的限制性酶(EcoRIPstI)切割，并与被同样双酶切的pUC18载体进行连接，然后转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,构建含silD扩增片段的亚克隆子，经蓝白斑筛选，得到了阳性克隆子，命名为pLYsilD。 毕业论文。

2.2 重组质粒pLYsilD的鉴定及其分析 代写论文。

将2.1获得的pLYsilD阳性克隆子经EcoRIPstI双酶切、EcoRI单酶切和PstI单酶切电泳检测，初步确认其阳性克隆子是目标克隆子(酶切电泳检测结果见Fig.2，外源DNA片段silD的限制性酶切位点见Fig.3)。经测序，pLYsilD的DNA序列总长为1181bp，对应于ORF的氨基酸序列为390aa。 论文网。