瑞舒伐他汀对冠心病患者单核巨噬细胞ABCA1及SREBP2表达的影响

作者：张培东 刘映峰 郭阳 缪绯。

【摘要】 目的 探讨瑞舒伐他汀对冠心病（CHD）患者单核巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)mRNA和固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）mRNA表达的影响。方法 体外分离并培养CHD患者单核细胞，经佛波酯（PMA）诱导48 h成为巨噬细胞后，分别给予0、0.1、1、5、10 μmol/L瑞舒伐他汀干预;提取细胞总RNA，用实时荧光相对定量PCR(实时RTPCR)检测ABCA1和SREBP2 mRNA的表达。结果 不同浓度瑞舒伐他汀干预组单核巨噬细胞ABCA1 mRNA表达水平存在差异（P＜0.05），给予0.1、1、5、10 μmol/L瑞舒伐他汀干预组的ABCA1 mRNA表达水平与空白对照组比较均有降低（P＜0.05）。不同浓度瑞舒伐他汀干预组SREBP2 mRNA表达量也存在差异（P＜0.05）,并且与对照组比较均有明显升高（P＜0.05）。结论 在CHD外周血来源单核巨噬细胞干预模型中，瑞舒伐他汀能下调胆固醇逆转运相关基因ABCA1 mRNA的表达，并且上调细胞内胆固醇合成相关基因SREBP2 mRNA 的表达。

【关键词】 瑞舒伐他汀；ATP结合盒转运蛋白A1；固醇调节元件结合蛋白2。

【Abstract】 Objective To investigate the effect of rosuvastatin on expressions of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) and Sterol regulatory element binding protein 2 (SREBP2) mRNA in monocytes and macrophages of coronary heart disease (CHD). Methods Monocytes were isolated by density gradient centrifugation with separating medium. Cultured monocytes were induced into macrophages by phorbol myristate acetate (PMA) for 48 h. Each group were incubated with 0, 0.1, 1, 5 and 10 μmol/L rosuvastatin respectively. Total RNA of these cells were abstracted and real time RTPCR were performed to inspect the expressions of ABCA1 and SREBP2 mRNA in the cells. Results Amplification products of ABCA1 and SREBP2 have excellent specificity. The groups of different concentrations of rosuvastatin had different expression of ABCA1 mRNA levels (P＜0.05) in monocyte macrophages. The expressions of ABCA1 mRNA in groups given rosuvastatin were lower than those of control group (P＜0.05). The groups of different concentrations of rosuvastatin also have different expression of SREBP2 mRNA levels (P＜0.05).The expressions of SREBP2 mRNA in groups given rosuvastatin were higher than those of control group (P＜0.05). Conclusions In the model of macrophage induced from monocytes of CHD patients, the expression of ABCA1 mRNA can be downregulated and SREBP2 mRNA can be upregulated by Rosuvastatin.

【Key words】 Rosuvastatin; ATP binding cassette transporter A1; Sterol regulatory element binding protein 2。

瑞舒伐他汀（rosuvastatin）是最新的他汀类降脂药，大量多中心临床试验证明瑞舒伐他汀具有独特的强效降低低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)和显著升高高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)的疗效，是冠心病(CHD)一级和二级预防的良好选择，被成为“超级他汀”，为心血管疾病的预防和治疗前景带来了新的希望〔1〕。本研究以CHD外周血单核巨噬细胞为研究对象，探讨不同浓度瑞舒伐他汀对脂质逆转运相关基因ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和脂质合成代谢相关基因固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)表达的影响。

1 材料与方法。

1.1 研究对象和材料 人淋巴细胞分离液（LTS1077）为广州天骐生物公司产品，RPMI1640培养液为Genom公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，氟波酯（PMA）为Sigma公司产品，总RNA抽提试剂盒为美国Invitrogen公司产品，cDNA合成试剂盒为MBI公司产品，荧光定量PCR试剂盒(染料法)均购自美国Invitrogen公司上海分部，瑞舒伐他汀为英国阿斯利康公司产品（分子量为1 001.14，10 mg/片），其他试剂为国产或进口分析纯。荧光PCR定量仪器型号：BIOrad IQ5。

1.2 单核巨噬细胞的培养 选取来我院就诊经冠状动脉造影确诊为CHD的患者外周血20 ml，500 U/ml肝素抗凝，全血以Hanks液1倍稀释混匀，缓慢加入含有4 ml淋巴细胞分离液的离心管中，1 500 r/min离心后吸取环状乳白色淋巴细胞层，再以5ml Hanks液充分混匀，2 000 r/min离心洗涤2次；以10%胎牛血清的DMEM1640 4 ml将细胞吹开混匀，将细胞悬液每孔2 ml种于12 孔板中，37℃下CO2孵箱恒温培养。细胞浓度在106个/ml水平。培养2 d后的细胞，各组用含终浓度为50 ng/ml的PMA刺激48 h，使之转化为巨噬细胞。光学显微镜下观察细胞形态改变。

1.3 试验分组 试验共分5个组。空白对照组,仅加入含10%血清的RPMI1640培养液；试验组分别加入瑞舒伐他汀0.1、1、5、10 μmol/L。以上均为终浓度，每个组设3个复孔。

1.4 实时荧光相对定量PCR 总RNA提取：将细胞中加入1 ml Trizol液研磨吹打，室温放置5 min，加入氯仿（0.2 ml/1 ml Trizol液）摇15 s；取上层水相于一新的离心管，加入异丙醇（0.5 ml/1 ml Trizol液），4 000 r/min离心10 min；弃去上清液，加入75%乙醇（至少1 ml/ml Trizol液），4℃下2 000 r/min离心5 min；小心弃去上清液，室温下干燥5～10 min。将总RNA用无菌水溶解。

反转录：(1)取一灭菌的无RNA酶的EP管,每个样本加入如下成分得到混合物1:总RNA 5 μl，引物 1 μl，10 mmol dNTP 1 μl，加DEPC处理水至10 μl；(2)把混合物1 65℃温浴5 min，然后立即放冰2 min；（3）在混合物1里加入如下成分得到混合物2 共20 μl，体系分别有10×RT 缓冲液 2 μl，25 mmol镁离子4 μl，0.1 mol/L dTT 2 μl，RNaseout 40 u/μl 1 μl，SuperScrip Ⅲ RT （200 u/μl）1 μl，混合物 1 10 μl；（4）50℃处理50 min，85℃处理5 min，立即放置到冰上，在每管混合物2中加入1 μl的RNase H，37℃处理20 min；（5）所得到的cDNA可以保存到—20℃冰箱。根据Primer Express 2.0软件设计引物，由美国Invitrogen上海分部合成，设计的实时定量PCR上下游引物分别为ABCA1:5′ACCGAAGTAAGGAGTTGCTCATA3′和5′GTGATATGGCATCGTTGCATTT3′；SREBP2：5′CGTCCACCACCGACAGATGA3′和5′GAAGGCTGGAGACCAGGAAGA3′，βactin：5′GTGGACATCCGCAAAGAC3′，5′GAAAGGGTGTAACGCAACT3′。反应条件：95℃预变性2 min，以95℃10 s、60℃20 s、72℃ 45 s进行40个循环。采用BIOrad IQ5型号荧光PCR定量仪反应，反应结束后，进行扩增曲线及溶解曲线分析及结果统计。

1.5 计算方法 Ct(cycle threshold)值的含义：每个反应管内荧光强度达到系统能够辨认的目的DNA合成时的循环数(以阴性对照作参考)，cDNA含量越低，所对应的Ct值越高。△Ct=CtTargetCtβactin,ΔCt值即待测基因相对于内参基因的表达强度。ΔCt值越大表示待测基因表达水平越低，反之△Ct越小则待测基因含量反而越大。△△Ct= (CtTargetCtβactin)Test (CtTargetCtβactin)Control，Control指对照组〔2〕。基因表达相对量用2—△△Ct表示。

1.6 统计学分析 各组数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析。数值变量间比较采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)。

2 结 果。

2.1 PCR产物的确定分析 图1为ABCA1、SREBP2和βactin基因的融解曲线。ABCA1基因产物的融解曲线峰值为75.5℃，SREBP2基因RTPCR产物的融解曲线峰值为89.0℃，内参βactin基因RTPCR产物的融解曲线峰值为83.0℃。两目的基因及内参融解曲线无切迹，峰线锐利，证实其PTPCR产物特异性强，无异常扩增。

图1 SREBP2、ABCA1和βactin的融解曲线。

2.2 不同浓度瑞舒伐他汀干预组CHD患者单核巨噬细胞ABCA1和SREBP2 mRNA相对表达水平 不同浓度瑞舒伐他汀干预组单核巨噬细胞ABCA1 mRNA表达水平不同(P＜0.05)，瑞舒伐他汀组ABCA1 mRNA表达水平与空白对照组比较均有降低(P＜0.05)，见表1。不同浓度瑞舒伐他汀干预组SREBP2 mRNA表达量也存在差异(P＜0.05),并且较对照组升高明显表1 ABCA1和SREBP2 mRNA相对定量表达量与空白对照组比较：1）P＜0.05。

（ΔCt值降低)(P＜0.05)，见表1。采用2—△△Ct方法计算，瑞舒伐他汀0.1、1、5、10 μmol/L组SREBP2 mRNA较空白对照组下调分别为1.22、1.77、2.73、4.06倍；而ABCA1 mRNA较空白对照组下调分别为0.71、0.47、0.34、0.19倍。