甲状腺转录因子―2在C57BL/6J小鼠腭突发育过程中的时空变化

[摘要]目的 探讨C57BL/6J小鼠继发腭发育过程中，甲状腺转录因子（TTF）—2表达的时空变化规律，探讨TTF—2在腭突形成中的作用。

方法 于小鼠妊娠12、13、14、15 d分别断颈处死各6只孕鼠，无菌条件取出胚胎，解离腭突。

应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot和免疫组织化学染色方法定量、定位检测TTF—2在腭突中的表达。

结果 免疫组织化学定位检查在C57BL/6J小鼠的腭突发育过程（E12—E14）中，在腭突中嵴上皮细胞均有TTF—2的表达，而在腭突间充质细胞未见TTF—2的表达；腭突融合时，已不能检测到TTF—2表达。

TTF—2在腭突形成、上抬、接触的表达差异具有统计学意义（P毕业论文网 　　[关键词]甲状腺转录因子—2；腭中嵴上皮；逆转录聚合酶链反应；免疫组织化学 　　[中图分类号]R 782.2 [文献标志码]A [doi]10.7518/gjkg.2015.03.011 　　哺乳动物继发腭的发育是一个复杂过程，涉及到将口鼻腔正确分离的几个过程的协调一致，从腭突产生即胚胎第12天（E12）、上抬即胚胎第13天（E13）到两侧腭突相对运动接触直至融合即胚胎第14、15天（E14、E15），最后覆盖在口腔侧和鼻腔侧的黏膜分别分化为复层鳞状上皮和假复层纤毛柱状上皮，这些过程中任何一个环节发生改变都可引起腭裂。

甲状腺转录因子（thyroid transcription factor，TTF）—2属于叉头/螺旋翼结构域蛋白家族，TTF_2—/—小鼠和人类TTF—2基因纯合缺陷表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形。

在小鼠发育过程中，TTF—2有促进甲状腺前体细胞迁徙，抑制甲状腺前体细胞在迁徙过程中分化功能，但对腭突中嵴上皮细胞分化抑制是否有影响，尚不清楚。

本研究旨在观察在继发腭发育过程中，TTF—2的表达部位及其时空变化变化规律。

1.材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1实验动物 成年C57BL/6J小鼠（四川大学华西医学中心动物中心），雌鼠4—6周，体质量为12—14.5 g；雄鼠大于6周龄，体质量大于20 g，保持12 h昼夜周期制，室温控制在20—25℃，充足食物，自由饮水（pMR为5）。

1.1.2主要试剂 组织RNA提取试剂盒（Code No.SK1409，上海生工生物工程技术服务有限公司），cDNA合成试剂盒（Code No，D6120）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Code No.DR500A）购自宝生物工程（大连）有限公司，组织细胞蛋白裂解液RIPA（上海申能博彩生物科技有限公司），TTF—2羊抗小鼠多克隆IgG（Code No，SC—16392）、Actin（I—lq）羊抗小鼠多克隆IgG（Code No.SC—1616）（Santa Cruz生物技术公司，美国）；Protein Detecter Western Blot Kit BCIP/NBT System（Code No.55—11—50，KPL公司，美国）、聚偏二氟乙烯（poly—vinylidene fluoride，PVDF）膜（Merck Millipore公司，德国）、即用型过氧化物酶免疫组化试剂盒（Code No.SAl023，武汉博士德生物工程有限公司）。

1.1.3主要仪器 半干式电转膜仪（Bio—Rad公司，美国）、PCR仪（EppendorfO国有限公司）。

1.1.4 PCR引物 以反转录获得的eDNA为摸板，根据TTF—2 DNA的序列设计的引物进行PCR反应。

上游引物：5‘—CTGTGGACAATCACAATGG—3’；下游引物：5’—CCGACTTAGGGATGAAGG—3’；产物508 bp。

内参照根据小鼠磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde—phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因设计引物。

上游引物：5’—GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA—3’；下游引物：5’—TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG—3’，产物280 bp。

PCR引物合成均由大连宝生物公司完成。

1.2方法 　　1.2.1动物模型制备1）按雌雄比例2：1于前日晚8时至次日晨8时合笼，并于次日晨检查雌鼠，有阴道栓者为交配阳性，定此日为妊娠0天，记为E0。

2）于E12、E13、E14、E15分别断颈处死各6只孕鼠，通过剖宫产术无菌条件取出胚胎。

E12胚胎20只，E13胚胎21只，E14胚胎17只，E15胚胎19只。

3）将胚胎放入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）中断头，每组各5只胎头放入4%甲醛缓冲液中固定，用于免疫组织化学染色。

剩余胎头在放大1 2倍解剖显微镜下取腭突，用于提取总RNA和组织蛋白，进行逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT—PCR）和Westem blot检测。

1.2.2 RT—PCR检测胎鼠腭突组织TTF—2 mRNA表达Trizol法提取胎鼠腭突总RNA，反转录获得的eDNA。

以反转录获得的eDNA为摸板用PCR法扩增小鼠TTF—2 eDNA片段，内参照使用GAPDH。

PCR体系为：TTF—2 cDNfA模板1ug，20 pmol?L—1引物各1uL，dNTP（各2.5 mmol—L—1）4uL，Pyrobest DNA Polymerase（5 U?uL—1）0.25uL，6×Pyrobest反应缓冲液5 uL，加水至总体积为50uL。

PCRN环参数为：94℃2 min；94℃45 s，55℃40 s，72℃1 min，30个循环；GAPDH引物在PCR反应的第5个循环时加入；72℃延伸6min。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳后经扫描并用Bio—Rad软件进行灰度扫描分析。

以TTF—2与同一样品内对照管家基因GAPDH产物量的比值表示此样品TTF—2 mRNA近似含量。

1.2.3 Western blot检测胎鼠腭突组织TTF—2蛋白表达取腭突组织裂解上清液10uL经SDS—PAGE电泳后转移至PVDF膜上，封闭液封闭，4℃过夜，加入1：500稀释的羊抗鼠TTF—2多克隆抗体IgG于室温孵育1 h，PBS洗膜后，1：2 000稀释的AP—兔抗羊IgG于37℃孵育30 min，PBs洗膜后，BCIP/NBT显色。

用Bio—Rad软件进行灰度扫描分析。

1.2.4免疫组织化学方法检测TTF—2在胎鼠腭突中的表达 取E12—E15 C57BL/6J胎鼠腭突，用4%甲醛缓冲液中固定（pH=7.0）24 h后，石蜡包埋，5 um厚连续切片，行免疫组化染色和DAB显色。

以小鼠肝脏切片进行同样染色作为阳性对照，以牛血清白蛋白代替一抗进行染色作为阴性对照。

光学显微镜观察腭突中TTF—2阳性物。

1.3统计学处理 　　采用SPSS 11.5统计软件，数值以均数±标准差表示，对RT—PCR和Western blot灰度扫描测量结果的数据用t检验，P。