大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶3的
作者：冯建军，杨述华，孙立，唐欣。
摘 要：［目的］探讨在体外诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）的作用。［方法］将体外培养的骨髓间充质干细胞随机分为3组：对照组、诱导凋亡组、抑制凋亡组。应用Caspase3活性检测试剂盒，荧光比色法和Western blotting法检测失巢凋亡中Caspase3活性的改变；借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞凋亡的变化。［结果］流式细胞术显示诱导凋亡组出现了明显的凋亡峰，凋亡率随诱导时间的延长而明显增加；其它两组的凋亡率较低且较稳定。Western blotting检测和Caspase3活性荧光检测显示，诱导凋亡组Caspase3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高，且与细胞凋亡率相关，以后者更灵敏，其余两组活性无明显变化。［结论］Caspase3蛋白在诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡的过程中发挥着重要作用；抑制Caspase3的活性可以有效降低细胞失巢凋亡率。
Abstract：［Objective］To investigate the significance of Caspase3 in anoikis induced by preventing mesenchymal stem cells（MSCs）from adherence in vitro［Method］The cultured MSCs were randomly divided into 3 groups:control group,induced group and Caspase3 inhibitor groupMSCs anoikis was detected by flow cytometryThe caspase3 activity was evaluated by Caspase3 Fluorometric Assay Kit and Western blotting［Result］The flow cytometry analysis showd that apoptosis peak was appeared significantly in the induced groupand increased dramaticly along with the apoptosis conditions going onThe apoptosis rate of the others were lower and stableWestern blotting and fluorometric assay showed the caspase3 expressive level or activity in induced group was the highest and was related with its apoptosis rateThe fluorometric assay technique was sensitive to the western blotting［Conclusion］Caspase3 plays a vital role in suspended culture induced anoikis of MSCs in vitroDecreasing the activity of caspase3 by Caspase3 Inhibitor can reduce the anoikis rate。
Key words：Mesenchymal stem cells; Caspase3; Anoikis。
骨髓间充质干细胞作为组织工程最有希望的种子细胞之一，越来越受到重视。体外培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁生长特性，如果将它改变为悬浮状态，由胞外输入的存活信号通路就会中断，从而诱发失巢凋亡〔1、2〕。Caspase3（半胱氨酸蛋白酶3）是涉及细胞凋亡的重要蛋白酶，它的激活意味着细胞不可避免的发生凋亡〔3、4〕。本实验选用琼脂糖预先铺被培养皿的方法来阻止骨髓间充质干细胞贴壁〔5〕，诱导失巢凋亡，并应用Caspase3抑制剂（DEVDCHO）以探讨Caspase3骨髓间充质干细胞失巢凋亡中的作用。
1 材料与方法。
11 材 料。
低糖DMEM培养基、特优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国GIBCO公司；Caspase3抑制剂DEVDCHO：美国Clontech公司产品（购自上海吉泰科技有限公司）；Caspase3荧光检测试剂盒：BioVision产品（购自深圳达科为生物技术有限公司）；Caspase3多克隆抗体：美国Clontech公司产品（购自上海吉泰科技有限公司）；琼脂糖和其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
12 方 法。
取6～8周SD大鼠，平均体重150~200 g，雌雄不限。用断颈法处死。用75％酒精浸泡15 min后移入超净工作台中，剥离股骨和胫骨，冲洗、浸泡于无菌的PBS培养皿内，剪去骨两端，露出骨髓腔。用DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次。将含有骨髓细胞的培养液1 500 r／min离心10 min，弃去上清，用含10％FBS的DMEM全培养基重悬并接种于2~3个50 ml细胞培养瓶中。在37 ℃，5％CO2的培养箱中培养。于接种培养约12 h时换液，弃去未贴壁细胞。以后隔天换液，连续3次后改为每周换液2次。每天观察细胞形态并作记录。原代培养的细胞铺满整个培养瓶底面约80％时，即可用025％胰酶将贴壁细胞消化分离（37℃，2～3 min），然后按1∶2比例进行传代接种培养，传代培养的细胞生长约75％融合，重复传代操作。
倒置显微镜下逐日观察原代及传代细胞的生长情况和形态特征。收集第2代培养的细胞，用25％戊二醛于4℃下固定过夜；按标准SABC检测试剂盒说明进行免疫细胞化学实验，检测CD34、CD44、CD54、CD68、CD71抗原的表达。
123 实验及分组。
使用DMEM培养液溶解低熔点琼脂糖制备成约10％的混悬液，高温消毒后不待其冷却，立即取约25 ml铺被无菌60 mm培养皿底壁及侧壁。消化、收集第2代骨髓间充质干细胞，将其浓度调整为1×105／ml，取2~3 ml植入实验培养皿，转入37℃、5％CO2的培养箱中培养。
1232 使用DEVDCHO抑制琼脂糖诱导所产生凋亡的抑制凋亡组。
铺被琼脂糖的方法同调亡组。在植入等量细胞的同时加入DEVDCHO，混合均匀，使其终浓度成为50 μmol/L〔6〕，培养条件同上。
1233 正常贴壁对照组。
抑制凋亡2、6、12、24 h组；正常贴壁2、6、12、24 h组。
收集各实验组的细胞，制备成5×105／ml的活细胞悬液，终浓度为70％的乙醇固定过夜。离心、重悬2次以去除乙醇，加入PI染料，4℃避光放置30 min~1 h后上样检测。
Caspase3蛋白活性:按试剂盒说明书进行，激发波长400 nm，发散波长505 nm。Caspase3激活后，可切割底物液中的DEVDAFC并使AFC游离，未被切割的DEVDAFC发蓝光，而切割后游离的AFC发黄绿光，且可用荧光分光光度计在505nm检测。测定切割所产生的黄绿光的量可以表示Caspase3的活性。