替米沙坦对血管紧张素Ⅱ所致血管内皮细胞游离钙离子的方法建设
[摘要] 目的 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对细胞钙库的应激效应及替米沙坦对此的拮抗作用。
方法 预防性实验分组：正常对照组、AngⅡ 0.1 mol/L组和替米沙坦60、300、1000 g/L预处理组；治疗性实验分组：正常对照组、AngⅡ 0.1 mol/L组和AngⅡ+替米沙坦60、300、1000 g/L组。
体外培养的人大动脉血管内皮细胞预防性给予替米沙坦60、300、1000 g/L培育30 min后，加入AngⅡ 0.1 mol/L；或AngⅡ 0.1 mol/L培育30 min后，再加入替米沙坦60、300、1000 g/L，分别于共同作用0.5、2、8和24 h采用激光共聚焦扫描显微镜成像法检测胞浆游离钙离子浓度。
结果 预防性实验：与正常对照组相比，替米沙坦60、300、1000 g/L作用细胞30 min对胞浆游离钙离子浓度无明显影响，加入AngⅡ 0.1 mol/L后，胞浆游离钙离子浓度立即（0 h）显著升高，均显著高于正常对照组（P 0.05），但显著低于AngⅡ组，并且替米沙坦预处理浓度越高抑制作用越强（P 0.05），作用时间对此无影响。
治疗性实验：AngⅡ 0.1 mol/L先诱导30 min后，再加入替米沙坦60 g/L对升高的胞浆游离钙离子浓度无抑制作用；替米沙坦300 g/L作用2 h或替米沙坦1000 g/L作用0.5 h才显示其抑制作用（P 0.05），但均显著高于同一时间点的正常对照组。
结论 AngⅡ能诱导内质网钙库向胞浆释放游离钙离子，而替米沙坦能有效拮抗AngⅡ对内质网的应激作用及促使胞浆游离钙离子重新被内质网重吸收。
[本文转自专业提供代写物理教学论文和职称论文的服务，欢迎光临点击进入 ] [关键词] 替米沙坦；血管内皮细胞；血管紧张素Ⅱ；钙离子 [中图分类号] R972.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673—7210（2015）01（c）—0011—05 高血压、动脉硬化、冠心病等心血管系统疾病的发生发展过程中均存在着以内皮细胞所分泌的一氧化氮（NO）减少而致血管舒张反应下降为主要特征的血管内皮系统功能障碍[1]。
导致血管内皮细胞损伤的因素中，肾素—血管紧张素系统（RAAS），尤其是局部RAAS所产生的血管紧张素Ⅱ（angiotensin ，AngⅡ）在病理生理方面起着重要的作用[2]。
异常升高的AngⅡ可通过与血管内皮细胞内的AT1受体结合，引起细胞钙超载并启动一系列的细胞凋亡信息转导过程。
替米沙坦（Telmisartan）是新型的长效AngⅡ受体拮抗剂，其作用机制主要是与AT1受体结合，阻断AngⅡ对AT1受体的激动作用，作为临床一线降压药被广泛应用。
以往的研究显示，替米沙坦对由高糖或AngⅡ等因素所致的血管内皮细胞损伤具有保护作用[3—6]。
静息生理状态下，细胞内钙离子主要储存在内质网内，使细胞内游离钙离子保持在极低的水平约110—7mol/L，细胞内外的钙离子浓度差大约为一万倍[7]。
当遇到相应的刺激时，细胞会通过多种途径瞬间提高胞内局部或全部的钙离子浓度。
其中主要的途径包括胞外钙离子的内流和胞内内质网应激释放储存在其的钙离子。
细胞内钙离子浓度在细胞死亡过程中有变化，并且这种变化与许多病理状态相关。
已有的研究报道中，在探讨替米沙坦对内皮细胞胞内游离钙离子浓度影响时，较少区分引起胞内钙离子浓度变化的途径或给予限制，本文通过采用无钙离子细胞培养基，消除细胞应激后钙离子从胞外内流的途径，探讨AngⅡ刺激后胞内钙离子的变化，观察替米沙坦对内质网源游离钙离子浓度的调控作用，以细化这两类物质（药物）对胞内钙离子影响及其诱发细胞凋亡的基础研究。
1 材料与方法 1.1 材料 人大动脉血管内皮细胞株（VEC），PriCell公司；替米沙坦，森瑞化工有限公司；Ang Ⅱ，Sigma公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；高糖DMEM培养基，美国Hyclone公司；无钙DMEM培养基，美国Hyclone公司；Fluo—3/AM，Sigma公司。
替米沙坦和AngⅡ均用无钙无血清DMEM培养液溶解配成10 mg/L和2 mol/L母液，用时以无钙无血清DMEM细胞培养液调节终末浓度。
1.2 细胞培养 常规复苏血管内皮细胞株，以含血清DMEM培养基（90%高糖DMEM培养基，10%胎牛血清）制备浓度为1105/mL的血管内皮细胞悬浮液。
取10 mL血管内皮细胞悬浮液置于75 cm2无菌培养瓶内，在5%CO2、37℃、湿度95%的条件中孵化培养，隔天置换培养液。
当内皮细胞长至80%～90%融合时，以0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合液消化传代。
当细胞传至第3代时，将细胞接种于35 mm激光共聚焦玻璃底细胞培养皿中，细胞密度为5104个/mL，置回培养箱中继续培养，待细胞长满后进入分组、Fluo—3/AM负载及干预试验程序。
1.3 实验分组及处理 根据健康人体口服40、80、120 mg替米沙坦片测得的血浆药物峰浓度（Cmax）[8]，实验药物浓度设计为60、300、1000 g/L。
1.3.1 预防性实验 将接种于35 mm细胞培养皿中的血管内皮细胞分为5组：正常对照组、替米沙坦60、300、1000 g/L预处理组和AngⅡ 0.1 mol/L组。
试验添加药物前每组分别测定初始钙离子浓度（0 h），设为T0。
随后，各组培养基中分别加入培养液10 L（正常对照组）、浓度为0.036 g/L的替米沙坦10 L（60 g/L替米沙坦组）、浓度为0.18 g/L的替米沙坦10 L（300 g/L替米沙坦组）、浓度0.60 g/L的替米沙坦10 L（1000 g/L替米沙坦组）和培养液10 L（AngⅡ 0.1 mol/L组）。
替米沙坦预处理30 min后检测细胞内游离钙离子浓度（T1），除正常对照组外，其余组均加入浓度2 mol/L的AngⅡ10 L，并分别继续共同培养，于AngⅡ加入后瞬时（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽样检测细胞内游离钙离子浓度。
1.3.2 治疗性实验 将接种于35 mm细胞培养皿中的血管内皮细胞分为5组：正常对照组、AngⅡ 0.1 mol/L组，AngⅡ+替米沙坦60、300、1000 g/L组。
试验添加药物前每组分别测定初始钙离子浓度（0 h），设为T0。
随后，除正常对照组外，其余各组加入 0.1 mol/L的AngⅡ 10 L培养30 min后检测细胞内游离钙离子浓度（T1），再加入替米沙坦（加入浓度和体积同1.3.1项下），并。