海人酸致痫大鼠脑组织超微结构的改变及促红细胞生成素的保护作用
作者：吴绥生 谷金宁 李杰 张秀敏 王林全。
【摘要】 目的 观察海人酸（kainie acid,KA）致痫大鼠脑组织超微结构的改变及促红细胞生成素（EPO）的保护作用。方法 采用雄性Wistar大鼠9只，随机分为3组：对照组（PBS组）、模型组（KA组）和EPO组，在癫痫发作6 h后，应用电子显微镜观察心肌超微结构的变化。结果 PBS组：细胞核呈椭圆形，核膜清楚，核内染色质分布均匀，可见一个大而明显的核仁位于细胞核中央，粗面内质网轻度扩张；细胞质内可见平行排列的内质网。KA组:线粒体普遍肿胀、空化，线粒体嵴断裂，粗面内质网扩张、数量较少，细胞质内可见较多溶酶体，高尔基体轻度扩张，核固缩。EPO组:细胞核呈椭圆形，核仁清楚可见，核内粗面内质网排列整齐，线粒体无空化表现，粗面内质网丰富。结论 KA诱导的癫痫可以导致脑组织超微结构的损伤，应用EPO后脑组织的超微结构明显改善，减轻了由癫痫引起的脑细胞损伤，保护脑组织。
本研究旨在观察海人酸（Kainic acid，KA）致痫大鼠脑组织超微结构的改变及促红细胞生成素（EPO）的保护作用。
1 材料与方法。
1.1 动物来源。
实验动物选取雄性Wistar大鼠9只，体重（250±10）g，由吉林大学动物室提供（质量合格证：吉20080005），全部动物在室温下饲养。
1.2 仪器与试剂。
动物大脑立体定位仪（BUNKYOKV113TOKYO，日本）；超薄切片机（LKBIII，瑞典）；微量进样器（宁波）；牙科钻（ARATHON，韩国SAEYANG CO.公司）；透射电子显微镜（EM1200EX，日本）；EPO（怡宝，上海克隆生物高技术有限公司）；KA（美国Sigma公司）。
1.3 动物分组。
①对照组〔磷酸盐缓冲液（PBS）组〕：右侧杏仁核（前囟后2.0 mm，旁开5.0 mm，颅骨表面以下8.0 mm。）注射0.01 mol/L PBS 1 μl；②模型组（KA组）：KA致痫组；③EPO组：提前24 h经尾静脉给予稀释的EPO 500 μl（500 U/ml）后，KA致痫后持续6 h。每组3只。
1.4 模型制备与标本的留取。
Wistar大鼠称重后，用10%水合氯醛0.30 g/kg腹腔注射麻醉大鼠。上耳棒，将大鼠固定于立体定位仪上，并读出两外耳道的水平刻度，将立体定位仪水平线调零。用一个加热灯，使大鼠直肠温度保持在37℃。在头颅正中做菱形切口，暴露颅骨及前囟和后囟，将立体定位仪正中线调零。用小型牙科钻按上述坐标钻透顶骨，当钻至硬脑膜处时，停止钻孔，用钩针挑破硬脑膜后，用1 μl进样器向右侧杏仁核注入1 μg/ml的KA1 μl，速度为1 μl/min，注药后留针约5 min后，缓慢退出进样器，以保证药物被完全吸收。注射完毕，取针后，外敷青霉素，缝合皮肤切口，将大鼠放在50 cm×30 cm×50 cm敞口有机玻璃罩中，使大鼠能够自由活动，并进行行为学观察。每组达到癫痫发作标准后，用10%水合氯醛，按0.30 g/kg腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠固定于木板上，沿正中线剪开皮肤，沿肋骨下缘将腹部肌肉横切，用剪刀剪开，沿肋骨内缘将横膈切开，顿性剥离，沿胸骨柄左侧向上逐一剪断肋骨，用止血钳夹住胸骨柄及肋骨向外翻转，充分暴露心脏。将心脏固定后，再将输液针经左心室刺入到主动脉，剪开右心耳，打开输液器。用37℃ 0.9%生理盐水50 ml灌注动物，滴速为3.3 ml/min，灌注15 min。生理盐水灌注完毕后，立即改用4℃ 4%多聚甲醛和4%戊二醛混合液作为灌流液50 ml灌注动物，灌注20 min。灌注完毕后，取出心脏，放入培养皿中切取心尖部分放入2.5%戊二醛的固定液中固定，放入4℃冰箱中保存。经2.5%戊二醛固定后，再用1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKBⅢ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片；醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，JEM1200EX型透射电子显微镜观察、摄片。
按Racine分级法，将大鼠行为分为以下6级。0 级：正常行为状态。Ⅰ级：湿狗样颤动，面部痉挛抽动，包括眨眼、动须、节律性咀嚼等。Ⅱ级：Ⅰ级加节律性点头。Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛。Ⅳ级：站立并伴双侧前肢痉挛。Ⅴ级：持续站立、倾倒、失平衡、四肢抽动。Ⅳ级以上认为是充分点燃，完全点燃的标准是连续3次Ⅳ级或以上的运动性惊厥。
2 结 果。
PBS组细胞核呈椭圆形，核膜清楚，核内染色质分布均匀，可见一个大而明显的核仁位于细胞核中央（图1A），粗面内质网轻度扩张；细胞质内可见平行排列的内质网(图1B)。KA组：核固缩，线粒体肿胀、空化，线粒体嵴断裂，粗面内质网扩张、数量较少。细胞质内可见较多溶酶体，高尔基体轻度扩张（图1C、1D）。EPO组:细胞核呈椭圆形，核仁清楚可见，核内粗面内质网排列整齐，线粒体无空化表现，粗面内质网丰富(图1E)。