猕猴桃青霉病病原菌鉴定及中草药提取物对其抑菌效果
摘要了猕猴桃真菌病害导致贮运难题作者从湖南、陕西两猕猴桃主产区采集病分离获得青霉菌株Q应用 r 分子标记、BL比对结合传统真菌形态学鉴定确定该致病菌草酸青霉ll xl。
利用带药培养基法筛选出对侵染猕猴桃青霉菌有佳抑制作用草药提取物猕猴桃实采刺伤接种Q研究草药提取物对实病斑直径影响。
结表明川芎、肉桂、高良姜乙醇提取物对青霉有较抑制效菌丝生长相对抑制率分别达到979%、7767%、789%其以川芎抑菌效佳。
关键词猕猴桃； 青霉； 鉴定； 草药提取物图分类3663献标识码 06688zb078 g g r ll kr b rb xr gG X G 3 G X L B （ rlrl Rr grlrl g 05 ； brv xr r r rl r grlr g 05 ； 3 l r grlrl g 05 ）br lv l gl rv rg r kr g k ll l r kr ll r r r x rv Q B r q l BL lg rl rlgl g ll xl rb xr b bg ll xl r r b rgg l r rllg kr l xl r l vg rl l xr rz lg ll glgl ll g bg xl b r 979% 7767% 789% ll gr rvl g xr rz lg ll b gl v rg kr rg rb xr r gl r l r kr l xlK rkr； ll； ； rb xr獼猴桃是种深受消费者喜爱水营养极丰富。
维生素含量高还含量糖、蛋白质、氨基酸等多种有机物和人体必多种矿物质。
猕猴桃实青霉病是我国猕猴桃贮藏期主要病害湖南、陕西等猕猴桃主产区发生比较普遍症状面受损伤处呈现青绿色霉层易识别。
病原多种青霉主要由伤口侵入引起腐烂。
青霉不仅引起猕猴桃腐烂还危害柑橘、苹、梨、哈密瓜等叶片和实引起各种贮藏病害[]。
常用水贮藏保鲜抗真菌作用较强草药成分主要有丁香、木香、黄、荆芥、肉桂、茵陈蒿、川芎、肉豆蔻、黄连、黄芩、紫草和黄柏等[37]。
研究从湖南、陕西两猕猴桃主产区采集了青霉危害样对该病菌致病力、形态学、分子生物学特性进行比较分析筛选出对分离菌株有较强抑菌作用草药提取物以期猕猴桃贮藏期真菌病害防治提供理论依据。
材与方法 试验材猕猴桃青霉病病采湖南永顺、凤凰陕西县、周至猕猴桃主产区5每分别采集样品6份共计30份。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（）马铃薯 00 g、葡萄糖 0 g、琼脂0 g、蒸馏水 L。
试剂及仪器R 扩增仪KR B 生产 KR rl lr 600；核酸电泳仪VB L生产；蛋白质电泳仪上海天能生产300；电泳成像装置采用r B gr V；测序仪l B生产B R 3730XL qr；循环测序试剂盒采用Bg rr V 3 l qg K；川芎、肉桂、高良姜原购安徽蜀医药有限公司。
方法 病原菌分离纯化、致病性测定及柯赫氏法则验证将发病实表皮用清水清洗干净切取5 ×5 病组织数块用75%乙醇消毒0 随放入0%升汞消毒5 取出用无菌水冲洗3次将病组织放入马铃薯葡萄糖琼脂（）平板8℃黑暗培养分离纯化得到供试菌株。
将分离纯化菌株平板上8℃培养3～5 用打孔器打取直径 菌丝块。
每处理选取健康猕猴桃实0用接种针实腰部将实刺伤将菌饼有菌丝面紧贴实伤口处菌丝块表面覆盖湿棉球放入瓷盘密封保湿逐日观察各处理发病情况。
以接种不含菌对照。
从接种发病实上再次分离、纯化和培养病原菌并与原菌株进行比较。
病原菌形态学观察将菌株接种到平板上培养箱8℃避光培养 显微镜下观察病原菌分生孢子形态。
3 病原菌分子生物学鉴定从平板上用牙签挑取少量菌体50 μL裂缓冲液（KR L Br r rrg r R 96）80℃下变性5 变性离心取上清作模板。
使用KR g R K（ RR78）扩增目片段。
R反应体系50 μL其模板（变性反应液） μLR rx 5 μL rr rr （0 lμL） 05 μL Rvr rr （0 lμL） 05 μL 3 μL。
扩增程序9℃ 5 ；9℃ 30 55℃ 30 7℃ 30循环；7℃ 5 ；扩增完毕取0 μL扩增产物用%琼脂糖凝胶进行电泳检测[8]。
R产物送宝生物工程（连）有限公司测序。
将所得序列提交到GBk核酸序列数据库获得登录。
将序列作相似性差异分析确定该菌株分类地位用法（gbrg ）构建系统进化树。
草药提取物对青霉抑菌作用精选川芎、高良姜、肉桂原切碎取肉桂粗粉各0 g。
分别以乙醇溶剂氏法提取3 提取液滤减压回收乙醇至无醇味热水分散放冷石油醚（60～90℃）脱脂3次水液浓缩80℃干燥成干浸膏粉碎成细粉供试[9]。
取配制草药提取液母液与培养基混合匀制成浓85 gL带药培养基将其倒入9 培养皿以相量无菌水代替草药母液作对照[0]。
提取物对青霉抑菌效采用改良菌丝生长速率法[3]即含药培养基央用直径 打孔器打孔入50 μL 0× 06L青霉孢子悬浮液培养箱8℃培养7 观察试验结。
采用十交叉法测量各菌落直径计算各处理菌落直径平值和菌丝生长相对抑菌率。
抑菌率kk×00%；公式k对照组菌落净生长量草药处理组菌落净生长量。
5 草药提取物对猕猴桃实损伤接种青霉抑菌效选取外观整齐、无病虫害和机械损伤猕猴桃用75%乙醇消毒晾干备用。
用接种针实表面穿刺接种对照组只接种Q病原菌处理组先接种孢子浓06～07L青霉孢子悬浮液50 μL稍晾干接种草药提取物处理液设有空白对照。
伤口晾干将实放包装盒外套塑袋保湿6℃贮藏。
每隔 观察发病率和病斑直径。
持续观察7。
每处理设3次重复每重复8实实损伤接种病斑直径测量采用十交叉法[]。
结与分析 猕猴桃青霉病病原菌筛选分离及致病性测定从30份样品共分离到6株具有较强致病性青霉健康猕猴桃接种这6株青霉其发病症状与然发病症状致所有对照无发病症状。
对接种发病组织进行再次分离能得到与原接种菌落特征相分离物[5]。
续试验取菌株Q进行。
猕猴桃实上分离青霉形态学特征如图所示菌株Q培养基上菌落暗青色粉粒状生长速较快边缘呈白色。
从背面观察培养基发现培养基由浅黄色慢慢變黄褐色并随着培养延长而逐渐加深。
分生孢子呈念珠状串生单孢无色近球形（图b）。
3 猕猴桃实上分离青霉分子生物学鉴定将菌株Q基因序列提交至GBk获得登录6697。
病原菌琼脂糖凝胶电泳结见图3。
将所得序列作相似性分析确定了该菌株分类地位构建了系统进化树结（图）表明菌株Q与登录K735935和登录KX67635性高综合比较病原菌形态学特征结合序列比对结可以得出菌株Q草酸青霉ll xl[6]。
几种草药提取物对青霉抑菌情况表結可以看出肉桂、高良姜和川芎提取物对Q抑菌效良尤其是川芎提取物对Q抑菌率高达到了979%。
5 草药提取物对猕猴桃实采刺伤接种Q病斑直径影响猕猴桃实接种Q菌株 病斑直径不断增加但草药提取物处理显著抑制了实病斑扩（图5）。
综合比较川芎、高良姜、肉桂三种提取物处理结川芎提取物抑制效突出高良姜提取物其次肉桂提取物。
3 结论与讨论草药提取物具有良杀菌作用对人体和环境无危害增加了水食用安全性用水保鲜有很效。
将草药提取物应用到食品防腐优就是腐烂率低很少甚至不影响食品原有风味。
再者草药简单易得、取材容易、济实惠草药提取物替代化学合成保鲜剂用水贮藏保鲜有着广阔发展前景。
研究对猕猴桃青霉病病原菌进行了筛选、鉴定应用 r 分子标记分析、BL比对结合传统真菌形态学鉴定确定致病菌Q草酸青霉ll xl。
作者从众多草药提取物筛选出川芎、高良姜、肉桂三种草药提取物对猕猴桃青霉病病原菌抑菌效较将三种抑菌效较草药提取物用猕猴桃实采刺伤接种青霉防腐发现对病斑直径扩仍有较抑制作用。
续试验作者会进步验证试验发挥抑菌作用几种草药提取物主要抑菌成分力争将试验结可以直接应用生产实践、猕猴桃贮运难题。
参考献[] 闵晓芳邓伯勋陈丽锋等柑橘采致病青霉鉴定[]树学报007（5）653656[] g L g ZG Xg rg r lr b ll x [] rl rl rblg 007 （3） 666[3] 曾荣陈金印张阿珊等植物提取液对柑桔采青霉、绿霉抑菌活性研究[]江西农业学学报003（6）5[] 曾荣张阿珊陈金印等植物防腐剂蔬保鲜应用研究进展[]国食品学报07（）665[5] 陈玉环彭旋陈楚英等三颗针提取液复合涂膜对“纽荷尔”脐橙贮藏保鲜影响[]江西农业学学报0638（3）6975[6] 张阿珊曾荣陈金印等丁香提取液对脐橙采生理相关酶活性影响[]江西农业学学报033（6）06707[7] 陈楚英陈明陈金印等壳聚糖涂膜对新余蜜橘常温贮藏保鲜效影响[]江西农业学学报03（6）7[8] 段爱莉雷玉山孙翔宇等猕猴桃实贮藏期主要真菌病害r鉴定及序列分析[]国农业科学036（）8088