S—100蛋白与Cathepsin D在先天性巨结肠诊断中的应用

作者：陈卫坚，周小渔，李梨平，贺新玉，范丽明。

【摘要】; 目的; 观察S—100蛋白（S—100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）在先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）中的表达。; 免疫组织化学染色观察25例HD患儿及10例对照组儿童结肠。结果; （1）在正常对照组与HD扩张段组肠壁肌间和黏膜下层可见CAD只对神经丛中神经节细胞阳性表达，对神经纤维与神经胶质细胞均不表达。S—100染色与CAD染色相反，神经纤维与神经胶质细胞均阳性表达，神经节细胞阴性表达，表现为阳性神经丛中细胞状“空白区”。（2）在HD狭窄段组肠壁神经丛中缺乏CAD阳性表达。S—100染色神经丛中细胞状“空白区”未观察到；S—100强阳性表达的神经纤维束显著增生，扭曲呈波浪状。结论; S—100和CAD的免疫组化染色对诊断HD具有重要意义。

; 【关键词】; 先天性巨结肠; 组织蛋白酶D; S—100蛋白。

; Application of S—100 protein and cathepsin D in diagnosis of Hirschsprung’s disease　　　　【Abstract】; Objective; To observe the expression of S—100 protein(S—100) and cathepsin D(CAD) in the colon of patients with Hirschsprung’s disease(HD).Methods; Colons from 25 children with HD and 10 controls were stained for S—100 and CAD by immunohistochemistry.Results (1) In the controls and the dilated intestine segment of the HD，CAD—positive ganglionic cells were observed in myenteric and submucosal plexus. S—100 positive nerve fibers and gliocyte stained were negative to CAD. ganglionic cells—like blank area in the plexus stained were negative to S—100. (2) In the stenotic segment of HD，neither CAD—positive neurons nor cell—like blank area in S—100 stained were found in the plexus.S—100 positive fibers were proliferated obviously; and wave—like in their appearance.Conclusion; The expression of S—100 and CAD immunohistochemistry—staining has an important significance to the confirmed diagnosis of HD.

; 【Key words】; Hirschsprung’s disease; cathepsin D; S—100 protein。

; 先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）是小儿外科常见的消化道畸形，主要病理改变是远端病变段肠管神经节细胞缺如。在HD的病理诊断中，有部分病例，尤其是新生儿病例，由于肠壁神经系统发育不完全，神经节细胞欠成熟，形态不典型，与神经丛中神经胶质细胞难以鉴别。而且多数患儿并发肠道感染，肠壁内有较多炎细胞浸润，使HE切片中神经节细胞难以辨认。这些原因均可造成HD不易明确诊断。本应用免疫组织化学（免疫组化）方法，观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经组织中S—100蛋白（S—100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）的表达结果，加以，以明确诊断HD。

; 1; 资料与方法。

; 1.1; 一般资料; 回顾我院2002年6月～2004年6月临床拟诊断为HD的手术切除标本25例。男22例，女3例，年龄1个月～4岁，其中≤3个月10 例，3个月15例，均经术后病理检查证实为HD，23例为常见型，2例为长段型。每例标本分别取近端扩张段切缘肠壁作为HD扩张段组，取远端狭窄段肠壁作为HD狭窄段组。10例横结肠或乙状结肠标本取自先天性无肛患儿造瘘术后切除的肠管，经光镜检查可见发育成熟的神经节细胞，作为正常对照组。

; 1.2; 检测原理; CAD是一种天冬氨酸蛋白酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族。在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记。S—100是神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中，可作为肠道神经丛中胶质细胞和神经纤维的标记。

; 1.3; 方法; 标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片，切片厚4μm，行CAD和S—100免疫组化染色。染色步骤采用非生物素两步法，用已知阳性的神经节细胞瘤作为阳性对照片，用PBS代替一抗作为阴性对照片，DAB显色。一抗、二抗及DAB显色剂均购自上海长岛抗体生物诊断试剂有限公司。一抗抗CAD抗体和抗S—100抗体工作浓度均为1∶60，鼠/兔通用型二抗工作浓度为1∶100。观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经丛中神经节细胞、神经胶质细胞及神经纤维的染色结果。

; 1.4; 结果判断; 棕黄色为阳性信号，CAD、S—100的阳性表达部位均位于细胞质。观察指标以“+++、++、+、—”表达染色的深浅。(—)为阴性染色，(+)为弱阳性染色，(++)为阳性染色，(+++)为强阳性染色。

; 2; 结果。

; 2.1; 正常对照组。

; 2.1.1; CAD; 肠壁肌间与黏膜下层神经丛中可见CAD阳性染色的细胞状棕黄色颗粒（见图1），经与HE切片对比后证实为神经节细胞的胞浆。神经节细胞的染色强度不一样，肌间神经丛内神经节细胞着色强于黏膜下神经丛。神经丛中神经纤维和神经胶质细胞中CAD均为阴性染色。在黏膜和黏膜下层中，有散在组织细胞，呈CAD弱阳性染色。

; 2.1.2; S—100; S—100对神经丛中神经纤维和神经胶质细胞表达均为阳性染色，在阳性染色的神经丛中可以观察到一种特征性形态，表现为深染的神经丛中有细胞状“空白区”（见图2）。经与HE及CAD染色切片对照后发现细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞的位置。

; 2.2; HD扩张段; CAD和S—100在HD扩张段肠壁的染色情况与对照组肠壁基本相同。

; 2.3; HD狭窄段。

; 2.3.1; CAD; 肠壁神经丛内缺乏CAD阳性染色神经细胞或神经纤维。

; 2.3.2; S—100; 肠壁肌间与黏膜下层神经丛内均未观察到细胞状“空白区”。肠壁各层都可见S—100强阳性的神经纤维束显著增生，形态扭曲呈波浪状（见图3，4）。

; 正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S—100、CAD表达情况见表1。

; 表1; 正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S—100及CAD表达情况。

; ;注：n为标本例数。

; 3; 讨论。

; HD在小儿胃肠道先天性畸形中发病率居第二位。HD的确诊依据是远端病变肠壁肌间与黏膜下层神经节细胞缺如。但是在神经嵴细胞的迁移、增生和发育的过程中，受多种因素的，神经节细胞可能完全没发育，也可能是发育不成熟。尤其在新生儿期这种发育不成熟的神经节细胞更常见，其在光镜下的形态与神经丛中的胶质细胞不易鉴别，加上炎症细胞的影响，可能造成误诊。借助酶组织化学和免疫组化染色方法可以帮助诊断。但酶组织化学方法染色结果不稳定，容易出现假阳性，需要有经验的病理医师对染色结果做出正确的判断。采用免疫组化染色标记神经节细胞，对HD明确诊断有较好的帮助。