微生物基因组学研究新技术
【摘要】基因组时代的来临，为现代生命科学的研究带来巨大的发展，而合成测序技术对基因组研究，尤其是微生物基因组研究起到显著推动作用。
本文就目前已经成熟的三种合成测序技术的特点和技术流程原理进行综述，并讨论该技术在微生物基因组学中的应用和前景。
毕业论文网 【关键词】：微生物；基因组学研究新技术；合成测序技术 人类基因组计划是自然科学发展历史上的一项非常伟大工程，从1990年到2002年，美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国六个国家的可削减完成了人类基因组30亿个碱基对的测定。
目前，自然科学发展到后基因组时代，人类对于测序技术的需求有增无减，尤其是针对不断出现的病原微生物的基因组序列，DNA测序技术在不断地高速发展，新一代的测序仪器也在不断的被研发。
ABI公司生产的Prism3730 DNA测序仪可以说是第一代最为先进的DNA测序仪，其针对基因组大小只有6百万碱基对的大肠杆菌病原株，测序成本却达到数百万人民币。
目前我国和世界整体的研究的水平还处在一个低水平阶段，目前最常见DNA检测方法已经难以满足医学发展的需要，所以我们需要提出新的方法来解决目前毛细管阵列的时间耗用长、经济成本高、普及使用率较低的一系列问题，提高生物基因技术和生物学的快速发展。
所以，随着研究人员的研究的不断深入，新的研究方法被我们挖掘出来，新一代的研究方法可以满足大批量生产的需要，普及使用率高，它就是新一代的DNA桑格法检测技术。
DNA新一代的检测技术主要分成两大类：合成测序技术和DNA单分子测序技术。
合成测序法主要有454技术、SOLiD技术和Illumina技术，这些技术已经成熟并被广泛应用于微生物组学研究，尤其是基因组学研究。
单分子测序法主要包括纳米孔测序等方法，这些技术更为超前但还不成熟，仍在不断改进之中。
本文就目前已经成熟的454技术、SOLiD技术和Illumina技术进行综述。
1 454技术 基于焦磷酸测序法，454公司于2005年底推出了革命性的的超高通量基因组测序系统――Genome Sequencer 20 System（454 GS FLX系统），该测序系统的推出以里程碑事件被《Nature》杂志报道，开创了边合成边测序（sequencing—by—synthesis）的测序方法的先河。
该系统的流程原理简单来说，就是：“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
目前，由于其具有读长长、易于拼接的特点，被广泛应用于微生物基因组测序中的从头测序研究，大部分新细菌物种的测序都由该技术完成。
454具体流程原理如下：第一：首先把需要检测的样品输入器皿，并且将DNA打成一个一个小的片段，将它打成300到800个大小均等的片段。
其次，通过目前的生物学技术并且利用多种标准分子的，制备文库样品，把具有特殊功能的分别接触到DNA片段上，选取特异性的时候，我们要进行编码，分别是3和5，这样就构成了一个简单的样品文库，构成一个以A、b 为两头的单链的DNA片段。
第三步，我们就可以对第二步完成的DNA单链进行检测固定，并且利用一个磁珠大约等于一个片段的DNA，充分利用这个手段，将DNA捕获磁珠将单链的DNA固定，接着把单个固定在磁珠上的单链的DNA进行乳化，此时我们通过扩增试剂来对样品进行乳化，让样品形成我们需要的油包水的混合物，并且把含有一个单链的DNA放在一个反应器里面，使得每一个都可以独立的完成扩增。
（5）一个磁珠=一条读长：在PTP板中放入携带DNA片段的捕获磁珠，然后将PTP板放置在454 GS FLX系统中，开始测序。
将四种碱基按照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板。
如果有碱基配对的发生，这时会释放出一个焦磷酸。
经过ATP硫酸化酶催化的合成反应和萤光素酶催化的化学发光反应，焦磷酸将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。
释放的光信号可被仪器携带的高灵敏度CCD实时捕获到。
每有一个碱基和测序模板进行配对，高灵敏度CCD就会捕获到一分子的光信号，并一一对应，从而准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
这也就是焦磷酸测序。
（6）数据分析：GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具分析所获得的测序数据，适用于达400MB的从头拼接和不同基因组的重测序这两种不同的应用。
2 SOLiD技术 SOLiD全称为supported oligo ligation detetion，它是在没有使用传统的聚合酶的连接反应之下，通过核苷酸的连接合成为基础，通过反应出新的连接酶，并且重新进行排序，扩增DNA片段。
这也是它的独特之处。
由于其测序速度以及数据拼接的困难程度较高，该技术在微生物基因组的高通量研究中应用较少。
SOLiD技术的具体流程原理如下：第一：对文库进行准备，测试的模板可以通过具体的应用来对不同的片段和末端的文库进行测试并且以此作为模板。
第二步将测试的模板和微珠以及导引物体一同放入反应器中，并且进行乳液PCR。
第三步将模板进行处理后，使其变性，此时就将模板上多余的微珠去除，并且此时可以将微珠上的模板和拨片进行结合。
（3）微珠沉积：用一块玻片，将3’修饰后的微珠通过共价结合沉积在上面。
在此过程中，每张玻片被沉积小室分成1个、4个或8个测序区域。
（4）连接测序：用8碱基单链荧光探针混合物作为SOLiD连接反应的底物，采用新的连接酶，通过多轮连接反应，放出不同的信号，进而完成序列测定的目的。
（5）数据分析：测序完成后获得SOLiD原始序列，该序列由颜色编码组成，再按照“双碱基编码矩阵”，将SOLiD原始颜色序列“解码”成对应碱基序列。
3 Illumina技术 Illumina技术由Illumina公司开发出来并以公司名称命名，其基本原理与454技术一致，但具有流程简单、样品需求低、数据质量高、成本低和应用灵活等特点[6]。
但该技术由于具有测序时间相对较长、测序读长较短（几十bp）、拼接出错率较高的缺点，在微生物基因组的从头测序中应用较少，但在已知微生物的重新测序和转录组测序中应用十分广泛。
Illumina技术的的具体流程原理如下：（1）制备DNA片段：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小DNA片段，并在片段的两个末端加上接头。
（2）产生DNA簇：利用表面连接有一层单链引物的芯片来完成。
按照碱基互补的原理，将DNA片段变成单链后，通过与芯片表面的引物结合被一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成一个“桥”。
经过30轮扩增，每个DAN片段得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。
第三步进行测试，为了可以获得每个模板的DNA片段的序列，我们要对收集到的荧光的信号进行结果分析。
根据这个流程，我们需要将带有四种荧光标记的DNTP通过核苷酸的3进行分割，确保每个循环只能允许单个的碱基进入，然后再进行第二个，反复的进行，一个一个切割下去，并且利用激光扫描读写每一个的dntp的种类，这样反复的实验操作，直到反应出每个模板都是双链的聚合。
最后一步就是将碱基进行一定的数据分析，为以后的检测提供数据，以方便进行二次的分析。
4 展望 合成测序技术对基因组研究，尤其是微生物基因组研究起到显著推动作用，人类可以对对更多的微生物物种进行测序和重新测序，也使完全测序和真实反映细胞转录组成为可能，这些都将对分子生物学和基因组学的发展起到巨大的推动作用。
因此，在微生物研究领域，目前GenBank数据库上已显示有上万个细菌与其它微生物基因组完成测序，并且还有大量测序计划正在开展中，通过全面了解微生物基因组遗传信息，新的微生物研究的高通量时代已经开启。
参考文献： [1] Ondov BD， Varadarajan A， Passalacqua KD， et al. （2008） Efficient mapping of Applied Biosystems SOLiD sequence data to a reference genome for functional genomic applications. Bioinformatics 24： 2776—2777. [2] Metzker ML （2005） Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res 15： 1767—1776. [3] Lander ES， Linton LM， Birren B， et al. （2001） Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409： 860—921. [4] Olivier M， Aggarwal A， Allen J， et al. （2001） A high—resolution radiation hybrid map of the human genome draft sequence. Science 291： 1298—1302. [5] Margulies M， Egholm M， Altman WE， et al. （2005） Genome sequencing in microfabricated high—density picolitre reactors. Nature 437： 376—380. 国家自然科学基金项目（81202941） 2012zr006安徽中医学院自然科学研究基金项目（2012zr006。