提高维生素C发酵中山梨醇转化率的自动控制补料方法研究
摘要：维生素C生产中的重要一步是L—山梨糖发酵。该发酵采用细菌将D—山梨醇氧化为L—山梨糖，分批发酵时，存在明显的底物抑制作用，因此很难获得高产率的山梨糖，而通过补料方式可消除底物抑制作用，改善山梨糖产率。本文在山梨糖发酵分批时采用了两种不同的补料方法：以0.6lh—1的恒定速率补入山梨醇含量为600gl—1的营养物，山梨糖的产率为12.64 gl—1h—1;以0.5—0.04lh—1的线性降低速率补入山梨醇含量为600gl—1的营养物，山梨糖的产率为17.01gl—1h—1。在产率方面后一种补料方式具有明显的优势，可以提高山梨糖产率，是较好的底物补料方法。
1 材料和方法。
1.1 材料。
70%山梨醇溶液，酵母粉，磷酸二氢胺，硫酸镁。
1.2 菌种及种子培养。
菌种：NRRLB—72。
种子培养：培养48小时后的成熟斜面接种于试管，试管培养基装量为10ml，30℃静止培养72小时，接种于1L摇瓶，摇瓶培养基装量为100ml，控制温度在30℃，摇床转速250rpm条件下发酵培养。
1.3 发酵培养。
1.3.1 发酵条件。
发酵采用7.0L搅拌发酵罐，培养基配方如上，通气量2.2vvm，转速700rpm，培养温度30℃，pH通过加入3N HCl自动控制在6.0。
1.3.2 600gl—1 山梨醇，0.6lh—1衡速补料分批发酵。
发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl—1 ，当生物量达4.2gl—1 时(对数生长期，约发酵8小时)开始以0.6lh—1衡速补入2.0L含有600gl—1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加。补料结束后继续发酵至山梨醇完全耗尽。
发酵中补料速率线性降低：F=500.00—62.64t(F单位是ml h—1，t单位是h)。发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl—1 ，当生物量达3.8gl—1 时(约发酵6小时)开始补入2.0L含有600gl—1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加，补料速率线性降低(0.5—0.04lh—1)。补料结束后继续发酵至终点。
山梨糖总产率计算如下：产生的山梨糖(gl—1)/发酵周期(h)。
2 结果与讨论。
2.1 600gl—1 山梨醇，0.6lh—1恒速补料分批发酵。
0.6lh—1恒速补料对发酵的影响。此条件下发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为25小时、9.85、316.00gl—1 ，山梨糖总产率为12.16 gl—1 h—1。由于补料较快，导致发酵11.5小时时反应液中山梨醇浓度由10gl—1 突然增至210gl—1，不利于菌体的生长，这也可能是山梨糖产率降低的原因，此时后山梨糖产率一直较低16.5 gl—1 h—1 。因此，为了在高山梨糖浓度时依然获得高产率，需要改变补料速率使山梨醇浓度低于抑制水平。
由于补料过快，使山梨醇浓度由10gl—1 突然累积到210gl—1，产生底物抑制作用，这样补料结束后，仍需要发酵一段时间。为了消除这一不利影响采取将补料速率线性降低(起始0.5lh—1)的方法。理论上，发酵与补料同时结束，有利于缩短发酵周期，提高山梨糖产率。
补料速率线性降低时的微生物生长和山梨醇、山梨糖浓度，发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为16小时、12.41、272.37gl—1，山梨糖总产率为17.01 gl—1 h—1 。
此补料方法与衡速补料相比，可以降低培养过程中山梨醇浓度(50—120 gl—1 ，6—13h;10—210 gl—1 ，8—11.5h)减弱对菌体生长的抑制作用(生物量12.41，9.85)，补料结束后 再发酵时间也由13.5h降低到3h。实验结果表明补料速率线性降低是个好方法，可以提高山梨糖产率。
在分批发酵的补料策略方面，也有许多其他方面的报道，Bosjnak et等尝试采用梯度补料，山梨糖产率为11.62gl—1 h—1;Mori 等采用纯氧通气，提高山梨糖产率到44.85 gl—1 h—1，但不经济;Srivastava和Lasrado的补料发酵研究山梨糖产率为12.6gl—1 h—1。与这些研究结果相比，补料速率线性降低优势明显。
3 结语。
在山梨糖补分批发酵中，山梨醇浓度为600 gl—1的培养基以0.6 l h—1衡速补料时，发酵周期25h，山梨糖产率及产量分别为12.64 gl—1 h—1和316.00gl—1;然而，以线性降低速率补料时，发酵周期16h，山梨糖产率及产量分别为17.01 gl—1 h—1和272.37gl—1。前者由于补料速度过快，使发酵液中山梨醇浓度处于抑制水平，延长了发酵周期，形成所谓二次分批发酵;而后者补料量呈线性递减，发酵液中山梨醇始终处于较适宜浓度，随着发酵进入恶化阶段，补入的山梨醇量也逐渐减少，这样使发酵达到最优化。
参考文献。
[1] Lockwood LB. Ketogenic fermentation processes. In： Under—kofl er LA， Hickey RJ， editors. Industrial Fermentations. Chemi—cal Publishing Co， 1954：1—23.
[2] Boudrant J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis： areview. Enzyme Microb Technol 1990;12：322—329.
[3] Damodaran M， Subramanian SS. Bacterial oxidation of sorbitolto sorbose. J Sci Ind Res 1951;5(10)：713.
[4] Bosjnak M， Pintar P， Gomercic K. Gradient fed—batch culture aseffi cient microbial oxidation method. Med Fac LandbouwwRijksuniv Gent 1991;56：1723—183030.