牙周韧带细胞植入量与牙周组织再生量关系的动物实验

【摘要】 　　目的 将不同数量牙周韧带细胞（PDLC）植入慢性实验性牙周缺损内，观察细胞植入数量与牙周组织再生量的关系，确定可促进牙周组织再生的有效细胞浓度和有效细胞数量。 方法 人工构建4只Beagle犬慢性实验性牙周缺损模型(5 mm×5 mm×3 mm的牙槽骨U型缺损)，分别将载有1×104、1×105和1×106 PDLC的胶原膜植入牙周缺损内。12周后行组织学观察，测量新生牙骨质(NC)长度百分率和新生牙槽骨(NB)面积百分率并行统计学分析。 结果 各组均可见不同程度牙周组织再生，1×104 PDLC组和1×105 PDLC组与对照组比较差别无统计学意义，1×106PDLC组的NB面积百分率较对照组显著增高。 结论 在实验性牙周缺损内植入PDLC，可促进牙周组织再生，其有效浓度为5×107 mL—1，有效数量为1×106 PDLC。

【关键词】 细胞 培养的 牙周膜 牙周组织 引导组织再生 牙周 组织工程。

牙周治疗的最终目的是阻止病变进一步发展，并实现牙周组织再生。近年来牙周组织工程的迅速发展为牙周治疗开辟了一条新途径，其种子细胞的选择成为国内外学者关注的热点。牙周韧带细胞（periodontal ligament cells,PDLC）作为牙周组织中的优势细胞，是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，也是牙周炎治疗后形成牙周新附着的主要细胞来源。研究证实,应用自体PDLC移植治疗慢性牙周缺损可显著促进牙周组织再生。但应用多少数量的PDLC才能达到促进再生的目的尚不明确。本实验以Beagle犬为对象，将不同数量的PDLC与载体材料复合后植入动物体内修复慢性实验性牙周缺损，通过组织学观察和测量，评价植入不同数量PDLC对牙周组织再生的影响。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 动物及分组 Beagle犬4只（受试牙24颗），年龄1岁半，体质量10～15 kg[四川省医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(川)200412]。24颗受试牙随机分为4组。A组：单纯引导性牙周组织再生术（guided tissue regeneration, GTR）组；B组：1×104 PDLC/GTR组；C组：1×105 PDLC/GTR组；D组：1×106 PDLC/GTR组 。

1.1.2 材料及设备 DMEM培养液（美国Hyclone公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），特级新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)，超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)，CO2孵箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（XDS1A，广州光学仪器厂），MTT（美国Sigma公司），离心机（德国Heraeus公司），生物显微镜(CX31，日本Olympus公司)，BIOGIDE再生膜（美国Osteohealth公司），酶标仪（德国Human公司），氯胺酮（江苏恒瑞医药股份有限公司），瞬康医用胶（北京瞬康医用胶有限公司），胶原膜（中国医学科学院生物医学工程研究所）。

1.2 方法。

1.2.1 实验性牙周缺损的制备 参照文献[1]建立慢性根分叉病变模型：实验动物麻醉后在下颌双侧第2、3、4前磨牙区颊侧制备5 mm×5 mm×3 mm的牙槽骨U型缺损，使颊侧根分叉完全暴露，用刮治器彻底刮除暴露根面的牙周膜，并在缺损处放置牙胶，缝合龈瓣，8周后即形成慢性根分叉病变模型。

1.2.2 犬PDLC培养 采用组织块法，全麻下拔除犬上颌第1前磨牙，刮取根中1/3牙周膜，在饱和湿度、体积分数为0.05的CO2、37 ℃标准环境下孵育。倒置显微镜下严密观察细胞生长状况，待细胞从组织块周围游出并铺满培养板底70%后，用0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA消化，进行传代，取第4代细胞用于实验。

1.2.3 细胞转移 将第4代PDLC分别调整细胞浓度至5×105、5×106和5×107 mL—1，各取20 μL转移到4 mm×4 mm的胶原膜上，即胶原膜上分别有1×104、1×105、1×106个细胞，培养24 h后用于实验。

1.2.4 细胞植入 全麻下常规翻瓣，去除残余牙胶和病变肉芽组织，并在缺损底部相应根面制备切迹作为组织学测量参照点，将复合物按实验分组置于骨缺损处，常规覆盖BIOGIDE膜，膜边缘超出骨缺损边缘2～3 mm，生物胶固定膜，冠方平齐龈缘，然后间断缝合龈瓣。术后3 d肌注庆大霉素8万U/d 。

1.2.5 标本制作及观察 12周后处死动物，取下颌实验牙区颌骨，经固定、脱钙，脱水、浸蜡、包埋，与牙体长轴平行、近远中向切片，苏木素伊红染色(HE染色)。光镜下进行组织学观察和测量：普通光学显微镜下，用多种放大倍数观察试验牙牙周膜、牙骨质、牙槽骨等在形态学上的特征和差异，拍照后以OLYSIA Bioautocell软件测量裸露根面上新生牙骨质（new cementum formation, NC）长度及新生牙槽骨（new alveolar bone formation, NB）面积，计算NC长度百分率和NB面积百分率[2]（图1）。

NC长度百分率＝NC长度总和两切迹间根面长度×100％ 　　NB面积百分率＝NB面积两切迹间缺损面积×100％。

a，b为新生牙骨质长度，c为两切迹间根面长度，均为曲线距离。

图1 新生牙骨质及新生牙槽骨测量方法示意图（略）。

Fig 1 Schematic furcation defect of new cementum (NC) and new alveolar bone formation (NB)。

1.3 统计学处理 采用单因素方差分析数据，并进行两两比较。

2 结果。

2.1 肉眼观察结果 实验性牙周缺损制备前，动物牙面可见少量牙石和菌斑沉积。缺损模型制成后，可见术区牙龈充血、水肿、牙龈退缩。细胞植入2周后即见牙龈炎症明显消退，12周后各组动物实验牙部位均未见明显牙石，牙龈附着良好；部分实验牙见少量软垢及1～3 mm左右的龈退缩；实验动物健康状况良好。

2.2 组织学观察 在普通光学显微镜下观察试验牙牙周膜、牙骨质、牙槽骨等在形态学上的特征和差异，各实验组和对照组均可见不同程度牙周组织的修复和/或再生（图2）。 　　NB表现为自根方切迹处向冠方生长，与原有牙槽骨连为一体。NB矿化程度尚较低，其中可见较多骨细胞和成骨细胞，有些部位可见多核巨细胞（图3A），表明骨组织既有吸收，又有重建；邻近牙周膜侧NB多为板层状排列的束状骨，邻近骨髓侧，骨板由哈弗系统构成，其外周有几层骨板呈同心圆排列，内有血管、神经通过。NC连续或不连续地覆盖于裸露的根面上，厚薄不均（图3B）。新生牙周膜表现为NC和NB之间呈功能性排列的纤维，为平行及斜行方向走形，含较多新生血管（图3C）。少数标本可见炎性细胞浸润区和长结合上皮附着的区域（图3D），未见根骨固连和牙根吸收现象。

2.3 组织学测量 各实验组和对照组NC长度百分率和NB面积百分率见表1。结果显示：B组和C组的两项检测指标与A组相比，差别无统计学意义(P0.05)。D组NC长度百分率虽然较对照组略高，但差别无统计学意义(P0.05)；D组NB面积百分率较A，B，C组明显增高，差别有统计学意义(P0.05)。 　　PDLC：牙周韧带细胞；GTR：单纯引导性牙周组织再生术；Dt：牙本质；NB：新生牙槽骨. A：GTR组；B：1×104 PDLC/GTR组；C：1×105 PDLC/GTR；D：1×106 PDLC/GTR组.