Skp2与P27kip1在鼻咽癌组织中的表达及意义

【摘要】 Fbox蛋白家族中的一员Skp2参与细胞周期抑制蛋白P27kip1泛素化降解，研究发现Skp2在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达增加。本研究旨在探讨Skp2与P27kip1在鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌多项临床病理特征的关系，并探讨两者的相关性。方法：鼻咽癌组39例，慢性鼻咽炎组24例。标本均经石蜡包埋，HE染色确诊。Skp2和P27kip1蛋白的检测采用免疫组化染色（PV9000二步法）。结果：(1) Skp2在鼻咽癌组织中的阳性表达率为71.79%，明显高于其在慢性鼻咽炎组织中的阳性表达率(41.67%),差异有统计学意义（P＜0.05）；P27kip1在鼻咽癌组织中的阳性表达率为35.90%，明显低于其在慢性鼻咽炎组织中的阳性表达率(79.17%)，差异有统计学意义（P＜0.01）；(2) Skp2、P27kip1的蛋白表达与鼻咽癌的临床分期、颅神经侵犯有关（P＜0.05），与年龄、性别、分化程度、颈淋巴结转移无关（P＞0.05）；(3) Skp2、P27kip1在鼻咽癌组织中的表达呈负相关（rs=—0.373,P=0.019）。结论：鼻咽癌中Skp2蛋白表达与靶蛋白P27kip1蛋白降解有关，Skp2、P27kip1可能与鼻咽癌的发生发展有关，联合检测Skp2、P27kip1蛋白表达可作为判断鼻咽癌生物学行为的指标之一。

【关键词】 鼻咽肿瘤 Skp2 蛋白 P27kip1 蛋白 细胞周期。

［ABSTRACT］ Objective: The Fbox protein Skp2 is required for the ubiquitinmediated proteolysis of the cyclindependent kinase inhibitor P27kip1. Overexpression of Skp2 has been reported in many cancers including breast carcinoma, gastric carcinoma and prostate cancer. The purpose of this study is to investigate the correlation of Skp2 and P27kip1 expression with the clinical pathological features of nasopharyngeal carcinoma, and the correlation between expression of Skp2 and P27kip1 in nasopharyngeal carcinoma.　Methods: Thirtynine cases of nasopharyngeal carcinoma and twentyfour cases of chronic nasopharyngitis were enrolled in this experiment. All specimens were proved by formallinfixed paraffinembedded slides with the hematoxylin eosin staining. Expression of Skp2 and P27kip1 was determined by using an immunohistochemical staining (PV9000 twostep kit). Result: The Skp2 labeling frequency (71.79%) in nasopharyngeal carcinoma was significantly higher than that (41.67%) in chronic nasopharyngitis(P＜0.05). The positive rate of P27kip1 expression in nasopharyngeal carcinoma was 35.90%, which was remarkably lower than that (79.17%) in chronic nasopharyngitis (P＜0.01). Expression of Skp2 and P27kip1 protein in nasopharyngeal carcinoma was correlated with the clinical stage and cranial nerve encroachment (P＜0.05), but not correlated with the patient age, sex, histological grade, or lymph node metastases (P＞0.05). Skp2 expression was inversely correlated with P27kip1 in nasopharyngeal carcinoma（rs=—0.373, P=0.019）. Conclusion: Expression of Skp2 protein may decrease the P27kip1 level in human nasopharyngeal carcinoma, indicating it is involved in the development of human nasopharyngeal carcinoma. Skp2 and P27kip1 may be used as hopeful markers for predicting the clinical pathological features and the prognosis of these patients.

［KEY WORDS］ Nasopharyngeal carcinoma; Skp2， protein; P27kip1， protein; Cell cycle。

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）为我国最常见的恶性肿瘤之一。多见于我国广东、广西等省，其发病率据国内观察为耳鼻咽喉科恶性肿瘤之首［1］，但它的发病机制尚未明确。肿瘤发生的共同特征是细胞周期调控机制的紊乱，导致细胞的失控性生长［2］。调控细胞周期的核心机制是由细胞周期蛋白（cyclin），周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase,CDK）,周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhinitors,CKI）构成的调控网络。

P27kip1是已发现的CKI家族中一类相对分子质量为27?KD的蛋白分子，可与cyclin及CDK结合，广谱抑制cyclinECDK2,cyclinDCDK4,6以及其他cyclinCDK的激酶活性。在正常的细胞中，P27kip1蛋白可以阻断外界刺激细胞进行细胞分裂，故认为P27kip1扮演着一种肿瘤抑制的功能，当细胞缺少P27kip1的作用时会引发癌症的发生［3］。

人体组织细胞中存在多种蛋白降解途径，其中泛素依赖性蛋白水解途径在真核生物中普遍存在，SKP1CullinF—box蛋白复合体（简称SCF复合体）作为泛素蛋白连接酶参与许多细胞周期调控因子的泛素依赖性蛋白水解作用，其中Fbox蛋白起特异性识别底物的作用，从而使SCF复合体具有特异性。

S期激酶相关蛋白2（Sphase kinaseassociated protein2,SKP2）是DNA复制所必需的人类Fbox蛋白家族中一员。在许多细胞周期相关蛋白的泛素依赖性蛋白水解途径中起到特异性识别底物的作用，从而参与细胞增殖与凋亡的调控，与肿瘤发生发展密切相关。目前，已有许多细胞周期调控蛋白被证明通过SKP2依赖性泛素—蛋白酶途径降解，其中CDK抑制因子P27kip1是最受人们关注的。

当受到恶性增殖信号的刺激，P27kip1的蛋白表达水平开始下降，一方面由于合成降低，更主要的是通过SKP2介导完成的泛素—蛋白酶体降解途径的速度提高（这个降解途径在细胞静止期作用很小，而在细胞接受增殖信号后明显增强）。P27kip1蛋白水平的下降减低了它对CDK或CyclinCDK复合物活性的抑制效应，导致CDK的活化效应递增，使细胞能够完成细胞周期G1S期的重要转换驱动细胞周期的运行，使细胞增殖、分裂过快、过多，至肿瘤形成。

目前SKP2、P27kip1在各种肿瘤中的表达及其两者的相关性已成为研究热点，如淋巴瘤、消化系统肿瘤、肺癌、口腔鳞癌等方面，但其与鼻咽癌的关系国内外均未见有关报道。本课题旨在探讨SKP2和P27kip1在鼻咽癌组织中的表达和意义，进一步研究鼻咽癌的生物学特性，了解其发病机制，或能有一定的理论价值和临床意义。

1 材料与方法。

1.1 实验对象 收集贵阳医学院附属医院2003年9月至2005年9月门诊耳鼻喉科纤维镜检查鼻咽部非角化性癌活检组织及贵医附院病理科部分存档鼻咽部非角化性癌活检组织蜡块共39例，慢性鼻咽炎活检标本24例。

鼻咽癌组39例中，男25例，女14例；32 72岁，按照鼻咽癌92TNM分期标准（福州）分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期10例，Ⅳ期15例。39例鼻咽癌患者均未行过放化疗，其中28例伴有颈淋巴结转移，15例伴有颅神经侵犯症状。慢性鼻咽炎组24例中，男10例，女14例，25 68岁。所有标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色复检确诊。两组患者的年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 检测方法 鼠抗人Skp2单克隆抗体、鼠抗人P27kip1单克隆抗体、PV9000试剂盒、DAB显色剂、Citrate枸椽酸盐缓冲液、PBS磷酸盐缓冲液。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

实验步骤均按试剂盒说明书进行，严格控制实验条件，每组实验均设阳性对照和用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，每组均作常规HE染色。

1.3 结果判定 Skp2、P27kip1均以细胞核或细胞核伴胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，而只有胞浆出现棕黄色为非特异性染色。鼻咽癌组织以癌细胞核着色为阳性细胞；慢性鼻咽炎组织以黏膜上皮细胞核着色为阳性细胞。取染色良好（阳性细胞染色清晰，背景染色低）的组织切片，用半定量法［4］行结果判定。A按阳性细胞比例评分：在高倍镜下（×400）随机选取5个阳性细胞数多的视野计数，计数阳性细胞及总细胞数，求出阳性细胞所占总细胞数的百分比，取其平均值，并计分：无细胞染色为0分,阳性细胞≤25%为1分，阳性细胞占26% 50%为2分，阳性细胞占51% 75%为3分，阳性细胞＞75%为4分。B按染色强度计分：不染色为0分,呈淡黄色为1分,呈黄色为2分,呈棕黄色为3分。最后以A×B的值划定标准：≥3分可判为阳性，3 5分为（＋），6 8分为（＋。

2 结 果。

2.1 Skp2和P27kip1蛋白在鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中的表达情况 Skp2蛋白在鼻咽癌癌细胞核部位染色阳性，细胞浆中无表达，阳性细胞弥漫散布于鼻咽部黏膜上皮层及黏膜下，癌灶处癌细胞表现为Skp2蛋白染色强阳性（图1），而在慢性鼻咽炎组织中阳性染色较鼻咽癌组明显减少（图2）。39例鼻咽癌组织中Skp2蛋白总阳性表达率为71.79%，强阳性表达率为56.41%；24例慢性鼻咽炎组织中Skp2蛋白总阳性表达率为41.67%，强阳性表达率为25%，两组差异有统计学意义(χ2=5.63，P＜0.05)。

鼻咽癌组织Skp2的阳性表达(PV9000二步法，10×40)。

慢性鼻咽炎组织Skp2的阳性表达(PV9000二步法，10×40)。

鼻咽癌组织中P27kip1蛋白表达明显减少（图3），P27kip1蛋白在慢性鼻咽炎黏膜上皮中分布未见明显特异性。

鼻咽癌组织P27的阳性表达(PV9000二步法，10×40)。

39例鼻咽癌组织P27kip1蛋白总阳性表达率为35.90%，强阳性表达率为17.95%，显著低于其在慢性鼻咽炎的总阳性表达率79.17%，强阳性表达率58.33%（χ2=11.15,P＜0.01），见表１。

+++P27kip1—+++11691325743慢性鼻咽炎1444568。

2.2 Skp2和P27kip1蛋白表达与鼻咽癌多项临床病理特征的关系 Skp2和P27kip1的蛋白表达与鼻咽癌的临床分期、颅神经侵犯有相关性（P＜0.05），与年龄、性别、鼻咽癌的分化程度、颈淋巴结转移无相关性（P＞0.05），见表2。

2.3 鼻咽癌中Skp2与P27kip1蛋白表达的关系 经Spearman等级相关分析，在鼻咽癌中Skp2与P27kip1蛋白表达呈明显的负相关（rs=—0.373,P=0.019）。nSkp2+P值P27kip1+P值年龄 ≤60岁2315(65.22)0.1640.186 ＞60岁1613(81.25)性别 男2517(68.00)0.2350.215 女1411(78.57)组织学分类 低分化3627(75.00)0.16913(36.11)0.46 中高分化临床分期 Ⅰ、Ⅱ期140.0260.035 Ⅲ、Ⅳ期2521(84.00)颈淋巴结转移 L(+)2822(78.57)0.10410(45.45)0.287 L(—)颅神经侵犯 N(+)14(93.33)0.0180.019 N(—)2414(58.33)12(50.00)。

3 讨 论。

肿瘤细胞的生物学特征是细胞周期调控机制的紊乱，导致细胞的失控性生长。细胞周期主要由正负调控蛋白调控。周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhinitors, CKI)是参与细胞调控的主要因子。CDK与cyclinCDK复合物正性催化细胞周期进程，而CKI 通过与cyclin、CDK或cyclinCDK复合物结合抑制并阻断细胞周期进程。

细胞周期的运行受多种因素调控，有两个主要的调控点：一个处于G1/S转折点—G1期检测点，是控制细胞进入S期的控制点；另一个处于G2/M转折点—G2期检测点。在G1期早期，cyclinD和CDK4,6复合物发挥正向调节作用，进入G1期中后期cyclinE和CDK2复合物进行正向调节［5］。

P27kip1是已发现的CKI的两大家族中（KIP家族和INK4家族）KIP家族的重要成员之一，可广泛抑制cyclinCDK复合物的活性，主要抑制cyclinECDK2、cyclinDCDK4等细胞G1期激酶复合物，使细胞停滞在G1期，从而实现其细胞负性调控功能。P27kip1蛋白功能受到抑制，则可能破坏其抑制调控细胞周期的功能，促进细胞过度增殖，阻止凋亡，以上过程可能是其参与细胞癌变的分子机制［6］。P27kip1作为细胞周期的负调控因子，通常被认为是一种抑癌基因［7］。但是，有关P27kip1在人类肿瘤中的大量研究却甚少发现P27kip1基因的缺失或突变，而是表现为P27kip1蛋白表达水平的大大减少。某些致癌基因则通过介导P27kip1蛋白的不稳定性，使其降解增加，达到致癌作用［8］。