中药血清药理学研究方法探讨与思考
作者：韩林 贾波 石含秀 沈涛 由凤鸣。
中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清,用含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术。1988年日本学者田真代一[1]提出了血清药理学的概念和实验方法。国内20世纪90年代初开始探索，近10年来此法越来越多地应用于中药药理的研究。
1．1 动物模型制备。
1.1.1 实验动物选择 不同种属的动物,血清成分不同,人与动物血清更存在差异。陆慧晶[2]认为,选择动物时应尽量选与人类生物特性近似的物种,制备血清的动物应与获取离体器官、组织细胞的动物相一致,从而缩小或避免动物血清之间以及动物血清和人类血清之间在理化、生物等特性上的差异,提高实验结果的可靠性。刘成海等 [3]提出,在体外培养实验中宜采用同一种单一血清,既为细胞提供营养,又为药物载体,还避免了多种血清的干扰。动物常采用大鼠小鼠、兔、豚鼠等来制备血清。一般家兔和大鼠应为首选。
1.1.2 离体组织(细胞)选择 体外培养细胞的供体动物与含药血清的供体动物应同种属。因为实验是要在体外尽可能准确的再现在体实验时药物与机体相互作用的整个过程,所以应尽可能减少因动物种属差异而造成的免疫反应。因此,在体外培养实验中宜采用同种单一血清,既为细胞提供营养,又为药物载体,还避免了多种血清的干扰[4] 。
1.2 动物给药方案。
1.2.1 给药途径 一般多用口服(灌胃) 给药方式制备含药血清,由于中药新型制剂不断产生,也可以用注射、皮肤、粘膜、呼吸等给药途径来试验制备含药血清。一般在制备含药血清时,供体动物的给药途径应该与临床给药途径一致，以避免由于给药途径的不同带来结果的差异[5]。
1.2.2 给药剂量 血清药理学很重要的一个问题是给药剂量的确定,合适的给药剂量,对保证实验的成功很重要。给药剂量目前尚无统一标准。因含药血清加入反应体系后,浓度被稀释,使反应体系的浓度达不到在体条件下的药物浓度。王力倩等6]发现,以参考公式:给药剂量= 临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度,计算给药剂量,得到的含药血清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用,而比上述参考公式计算的给药量小1 倍量的含药血清无明显作用。在这种情况下,如果反应体系出现阴性反应,并不能排除药物浓度过低而出现的假阴性反应。李仪奎等 [7]提出两种方法:一是增大给药剂量,即给药剂量= 在体实验的给药剂量×反应体系中被稀释倍数(同上述王力倩所提参考公式) 。然而,其不足之处是给药剂量与血药浓度并不是呈等比增加,况且受到灌胃药物浓度和体积的限制。二是按新药药理研究的技术要求设计剂量给药,将含药血清制成冷冻干燥粉,以冻干粉形式加入反应体系使其达到所需浓度。其优点是:根据需要提高体外反应体系中的含药浓度或形成等容,有利于血清的储藏保存。王宁生等 [8]认为,给药剂量以整体模型动物的有效剂量8～18 倍为宜。笔者认为，实验给药剂量,最好通过预实验解决。
1.2.3 给药次数与时间间隔 目前常用的方法有:1 次给药或间隔2～4 小时给药，或1天1～3 次,连续3～10 天。根据药代动力学理论,以固定给药时间间隔,相同剂量多次重复给药后血药浓度达到稳态,并将在稳态下不同采血时间取得的含药血清进行实验,均表现较高而且相似的药理作用强度。孟李[9]就复方丹参血清对中性粒细胞释放活性氧的影响,探讨含药血清制备方法的实验,证实了此观点。说明同一给药方案连续数日给药较1 次给药有明显差异,与药物诱导机体产生内源性生物活性物质有关[10] 。此结论目前已成共识。目前国内很多学者提出每天给药3 次,连续5～7 天的给药法,认为与临床用药情况相合同时蓄积的血药浓度已近坪值。
1.3 采血时间 理想的采血时间应该在血药浓度的高峰期。蒙一纯[11]认为,根据实验动物消化生理特点和中药吸收转化特点确定取血时间范围是合理的。如大鼠一般1～2小时 可达血药浓度峰值,此时血清即为含药血清;时间延长将有部分药物组分发生转化,成为药物代谢血清。一般采血时间多集中在末次给药后30min～3小时间。由于中药复方给药后,不同药物达峰时间不同,故对于采血时间很难有一个统一标准。笔者认为应对不同时间分别采血进行预实验,将不同时间的含药血清进行比较后再确定采血时间,是较为可靠和科学的方法。
1.4.1 含药血清的预处理 血清中有许多酶、抗体、补体及其他生物活性物质,它们对体外培养的组织细胞及离体组织器官可能有作用,甚至严重影响实验结果。 因此，在许多情况下有必要对血清进行预处理。通常有3 种方法。①丙酮法: 向血清内加入4～5 倍量丙酮,混匀,于3000 r/ min 离心,取上清液温水浴上蒸发,除去丙酮; ②乙醇法: 向血清内加入4～5倍95%乙醇,混匀,于3000 r/ min 离心,取上清液温水浴上蒸发,除去乙醇; ③加温法: 56 ℃水浴上放置30min。这3 种方法主要去除了血清中的大部分蛋白质、糖及部分电解质,血清的正常生理活性基本丧失,容易突出血清中中药的作用。同时,从实验中可看到,灭活血清不易起泡沫,对实验干扰较小。赵万红等[12]认为,在对含药血清进行灭活时还要考虑两点: ①这3 种处理方法并不能去掉血清的所有正常活性; ②有可能去掉或减弱血清中中药的作用。这些情况没有统一的解决办法。
1.4.2 含药血清的保存 周明眉等 [13]以含头风饮血清抗血小板释放52HT 和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标,探讨了低温保存和血清灭活对含药血清的影响。研究发现含药血清经长期低温保存(—20℃,2个月) 后药效显著降低(P0.01) ,提示含药血清在保存过程中其中药有效成分会发生分解等变化,致使药效成分含量显著降低,即使低温冷冻保存仍影响其药效。故进行血清药理学试验时宜使用新鲜灭活或保存时间较短的含药血清。
1.5 含药血清加入量和对照组的设立 从实验设计的角度考虑血清药理学实验方法时,应控制好实验结果的真实性和可比性,基本原则是:一是研究含药血清的加入量来评价血清中药物的真实有效浓度;二是设立正常血清空白对照组来排除血清本身所含干扰性物质对实验结果的影响。张玮函等[14]研究了当归补血汤及其含药血清对小鼠红系造血祖细胞克隆的影响。结果显示,等剂量的2 组当归、黄芪,其含药血清与正常血清比分别为1∶5 和1∶1 ,归芪1∶5 组促进CFU2E 和BFU2E 的增殖的作用要明显强于1∶1 组(P0.01) 。严永杰等[15]探讨了反应体系中含药血清的加入量对实验结果的影响。实验显示,当头风饮含药血清与富含血小板血浆(PRP) 的比值为1∶4 时血清抗血小板释放52HT 作用最强.一般认为,以10 %的血清添加量为宜[16];血清中含有许多活性物质,它们当中大多会对药效结果产生一定的影响,为排除实验当中的此类干扰因素,实验过程中必需设立严格的空白血清对照组。