含bFGF的壳聚糖－胶原复合支架对牙周膜细胞生长和增殖的影响
【摘要】 【目的】探讨含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架对人牙周膜细胞（HPDLC）生长和增殖的影响。【方法】 MTT法观察含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液、不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液以及正常细胞培养液对HPDLC生长和增殖的影响，利用流式细胞仪（FCM）检测上述3种液体对HPDLC细胞周期的影响，并将HPDLC接种于含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架和不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架内，通过免疫细胞组织化学和激光共聚焦显微镜来检测HPDLC在复合支架内的存活和增殖情况。【结果】 含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液对HPDLC生长和增殖的促进作用明显强于不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液和正常细胞培养液，而后两组间无统计学意义；含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架浸出液促进HPDLC从G1期进入S期；HPDLC在含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架内的生长和增殖也明显优于不含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架。【结论】 含bFGF因子壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架可以促进体外培养的HPDLC生长和增殖。
【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子； 壳聚糖； Ⅰ型胶原； 复合支架； 牙周膜细胞。
牙周组织缺损的修复主要针对牙周韧带、牙骨质和牙槽骨,目前利用组织工程材料修复牙周组织缺损的研究很多[1—3]。组织工程的三大基本要素是种子细胞、可降解的支架材料与细胞生长调节因子。当前组织工程化组织的构建方式有3种:①支架材料+种子细胞;②支架材料+生长因子;③支架材料+种子细胞+生长因子。本课题组在先期研究壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架材料的基础上[4],将人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cells, HPDLC)接种于含碱性成纤维细胞生长因子（recombinant human basic fibroblast growth factor， bFGF）的壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架内，观察细胞的生长和增殖情况，从而探讨这种新型复合支架用于牙周引导性组织再生的可行性。
1 材料和方法。
1.1 主要材料、试剂和设备。
壳聚糖（Sigma，脱乙酰度85%），Ⅰ型胶原(广州创尔生物技术有限公司), DMEM(Sigma)，胎牛血清(FBS, Gibco)，胰蛋白酶（Trypsin, Ameresco），波形丝蛋白（Vimentin, Sigma），角蛋白（Keratin, 博士德），SABC—FITC免疫组化试剂盒（博士德）， SAN YOMDF2192A T 型超低温保存箱(日本)，Unicryo MC2L —60℃冷冻干燥机(德国)，HITACHI S—3000N 扫描电镜（日本），激光共聚焦显微镜（德国蔡司）。
室温下将壳聚糖溶于0.2 mol/L乙酸并搅拌均匀，配成20 g/L的壳聚糖溶液，Ⅰ型胶原以同等浓度乙酸配成4.6 g/L的胶原溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，壳聚糖、Ⅰ型胶原按体积比1 ∶ 1混合，一组加入bFGF（10 ng/mL）为A组，另一组为B组，加入同等量的DMEM，搅拌均匀后离心除渣脱泡。将溶液倾入预冷的24孔板中在－20 ℃下冻存24 h，后移入冻干机冻干24 h，密封4 ℃保存。
1.3 壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架扫描电镜和孔径大小、孔隙率的测定。
取以上支架材料，浸入液氮后折断，分别对其表面和内部结构喷铂金处理，扫描电子显微镜下加速电压20 kV , 放大不同倍数观察，并在材料内部选取5 个高倍视野（100倍），每视野测量10 个孔径值，计算材料的平均孔径。采用液体位移法测定支架的孔隙率[5]。将支架样本切成5 mm×5 mm大小，置入体积为V1的无水乙醇中，5 min后负压吸引脱气，使乙醇充分进入多孔支架的孔隙中，直至再无气泡逸出，此时乙醇体积(浸没支架)计为V2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出，剩余乙醇体积计为V3。支架的孔隙率如下计算：e=(V1—V3)/(V2—V3)，每个样本测5 次，取其均值。
1.4 HPDLC的体外培养和鉴定。
参照Inoue培养方法[6]，取因正畸需要拔除的新鲜第一前磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，剪成1 mm3碎块，以含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，在饱和湿度、5% CO2、37 ℃条件下细胞培养箱中孵育，细胞快长满培养瓶底时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取第4或5代细胞用于实验。消化第5代HPDLCs，接种于六孔板中的盖玻片上，培养3 d后用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，正常山羊血清室温封闭20 min，滴加一抗（小鼠抗人波形丝蛋白(1 ∶ 500)，小鼠抗人角蛋白（1 ∶ 200）于4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加抗小鼠IgG—FITC荧光二抗，37 ℃避光孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加Hoechest 33342室温孵育20 min标记细胞核，0.01 mol/L PBS洗涤3次后荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。
1.5 MTT法和流式细胞仪检测。
将复合支架A（含bFGF）和复合支架B（不含bFGF）按3 cm2/mL (材料/培养液)的比例置含FBS的DMEM培养液中，37 ℃浸泡72 h，收集浸出液用于培养HPDLC。取生长良好的第5代HPDLC，调整细胞密度为1×105/mL接种细胞于96孔板，每孔100 μL。在饱和湿度、5%CO2、37 ℃标准环境下培养细胞48 h，弃去培养液及未贴壁的HPDLC。细胞分为A、B和C3组（每组32孔），分别加入浸出液A，浸出液B和含FBS的DMEM培养液，每孔200 μL。每组分为1、3、5和7 d4个时间点（每个时间点各8孔），分别于接种后1、3、5、7 d弃去培养液，每孔加入0.01 mol/L PBS 100 μL、MTT (1 mg/mL)液20 μL，继续培养4 h后弃去液体，加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min后，用分光光度仪以490 nm波长光测每孔吸光度(A490)值，SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析。取浸出液A和浸出液B 加入生长良好的第5代HPDLCs培养瓶中，培养5 d后消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期，以正常培养的HPDLCs作为对照，重复三次，结果行单因素方差分析。
取生长良好的第5代HPDLC，以2.5 g/L胰蛋白酶消化、收集和离心，Hoechest 33342标记细胞1 h，洗涤、离心后以正常培养液将细胞稀释成1×105 /mL备用。先将复合支架A（含bFGF）和复合支架B（不含bFGF）修成5 mm × 5 mm × 5 mm大小置于培养皿中，然后滴加细胞悬浮液100 μL，培养箱中静置1 h后再缓慢加入培养液，液面刚刚浸没复合支架，在饱和湿度、5%CO2、37 ℃标准环境下培养细胞。分别于培养1、3、7和14 d后取出复合支架，恒温冰冻切片机切片，片厚50 μm，按上述方法作波形丝蛋白免疫荧光化学染色。激光共聚焦显微镜下扫描支架，高倍镜下随机取10个视野，计数每mm2细胞数，每组样本每个时间点各5个复合支架。结果行One way ANOVA 检验。
2 结 果。
冻干后制备的壳聚糖－Ⅰ型胶原复合支架呈白色海绵状，表面粗糙，内部呈海绵状多孔隙结构（图1）。复合支架A和复合支架B微观结构一致，内部孔径测量分别为(158±17)μm 和(150±18)μm，孔隙率分别为90.8%±0.5%和91.1%±0.5％，两种支架的孔隙率无统计学意义（P 0.05）。