小连翘内生真菌种群分布及其抗菌性研究
作者：袁保红，杜青平，邓祖军。
【摘要】; 目的 分析小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)内生真菌的分布特征和抗菌活性。方法 采用内生菌分离法分离菌株，双培养法对峙试验测定其抗菌性。结果 从小连翘的根、茎、叶等不同的器官中分离得到81株内生真菌，经形态学分类鉴定分属于4个目，5个科，26个属，其中头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为优势菌群。不同部位内生真菌的类型、数量和分布存在差异，根部有31株，分属于12属；茎部有12株，分属于10属；叶部有38株，分属于13属。通过平板对峙实验发现，从小连翘所分离的内生真菌中54.32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论 小连翘内生真菌及其代谢产物中具有潜在活性物质，值得深入研究。
Studies on communities of endophytic fungi from Hyperioums sampsonii Hance and their antipathogenic activities in vitro。
Abstract: The endophytic fungi were isolated and identified morphologically from the roots, stems and leaves of Hyperioums Sampsonii Hance. Eightyone strains of endophytic fungi were isolated and belonged to 26 genera, 5 families and 4 orders. Cephalosporium sp. and Rhizoctonia sp. were the dominant genera. Among 81 strains, 31 strains of 12 genera were isolated in roots, 12 strains of 10 genera in stems, and 38 strains of 13 genera in leaves. The results showed that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi varied in different positions of Hyperioums Sampsonii Hance. In the dual culture tests, 53.48% of all the isolated Endophytic fungi showed antagonistic to some plant pathogens. These endophytic fungi inside the plants have intimate correlation with their hosts. These endophytic fungi and their metabolites might play an important role in the plants against the pathogens.
Key words:endophytic fungi; Hyperioums Sampsonii Hance; antipathogenic activities。
小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)，别名小翘、七层兰、瑞香草、元宝草等，为多年生双子叶植物药藤黄科植物，味苦、性辛、平［1］。全草含鞣质，有光致敏作用，动物食后可产生皮炎；含小连翘碱(hypecorine)和小连翘次碱(hypecorinine)；花含金丝桃素(hepericin)［2］，有活血、止痛、调经、止血、消肿之效；小连翘或其提取物作为有效药物成分用于制备治疗睡眠障碍、老年痴呆、记忆力减退等病症的药物［3］；同属植物贯叶连翘，在西方国家称圣约翰草，用于治疗忧郁症等疾病已有几百年的历史［4］。近年来的研究表明小连翘也具有抗忧郁作用［5］。文献报道，小连翘中含有聚（异）戊二烯二苯甲酮类衍生物、萘骈双蒽酮类和黄酮类等多种化学成分，这些成分是小连翘药理作用的主要有效成分，但是要提取和分离这些药物成分还有很多困难［6］。近来研究表明,某些药用植物中个别内生真菌能够产生与宿主相同或者相似药理活性的成分［7］，由此对药用植物内生真菌的研究引起人们的广泛关注。如果在小连翘内生真菌中能够发现类似的活性物质，无疑找到了一种可替代小连翘植物的新型生物资源。但是至今未见从小连翘中分离及其内生真菌的种群多样性的研究报道。本文对小连翘内生真菌进行了分离和分类鉴定，并对其种群多样性及内生真菌拮抗病原菌的活性的研究报道如下。
1; 材料与方法。
1.1; 材料 分离所用材料为小连翘的根、茎、叶，采自中国科学院华南植物园（广州）。采集其健康的组织，无其它病虫害，根、茎与叶分开采集，放于密封袋中，于4 ℃存放，尽快进行内生真菌的分离。 碘伏：威的牌消毒液，主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘（即碘伏），液体剂型，有效碘含量为0.5 %，是一种新型的PVP—I消毒剂，深圳市新华鹏消毒剂有限公司生产。 NS液：0.9 %NaCl；ST液：0.9 %NaCl，0.5 %吐温80；中和剂：0.9 %NaCl，0.5%吐温80，0.5 %硫代硫酸钠。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000mL，pH7.0。在进行内生真菌的分离时，向培养基中分别加入青霉素、链霉素至50 μg/mL。
1.2; 供试菌株 纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)、恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum)由中山大学生命科学院微生物和生化教研室提供。
1.2; 方法。
1.2.1; 植物材料的处理 样品采于2005年10月。样品用自来水冲洗干净后，取不同部位的茎或叶若干，剪成小块，分别放于三角瓶中；加入碘伏消毒液（使用时有效碘浓度为2 500mg·L—1），不断摇动，消毒5 min。吸去消毒液，加入无菌ST液，荡洗1 min，吸去液体。重复一次。经表面消毒后的样品可用于接种。
1.2.2; 内生真菌的分离、纯化 茎内内生真菌的接种：用无菌刀片削去茎的皮及已裸露的切面，然后切取约2～5 mm的切片若干，先置于无菌平皿中。再将样品置于无菌研钵中，加入石英砂和 1 mL ST液，将样品研成浆。取适量的浆液涂布于PDA平板。为了保证样品有足够的代表性，每个样品要用若干段茎，一段茎仅涂一个平板，共需涂5～10个平板。根叶样品的处理基本同茎。 将涂布好的平板置于28 ℃培养，每隔12 h观察真菌菌落形成情况。培养基中一出现菌落，立即将此处的小块琼脂挖出，将平板再放回28 ℃培养10 d，计数各平板上的菌落总数。挖出的含真菌的小块PDA立即置于含PDA的小试管中培养，待真菌长出后，再在PDA平板上采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养。在培养数日后，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应的记录，包括影象记录，对菌株编号后，转至PDA斜面培养基上，于28 ℃培养箱中培养5~7 d，然后放入4 ℃冰箱保存。
1.2.3; 表面消毒效果检测 表面消毒后的样品于5 mL无菌水中振荡1 min，取0.3 mL悬液涂布于PDA平板上，在28 ℃培养，记录是否有真菌生长。另外，采用存活试验观察表面消毒效果，即将分离的内生真菌菌苔经过各自表面消毒程序处理后，再接种到PDA平板28 ℃培养后，观察是否生长。
1.2.4; 菌种鉴定 从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片，置于光学显微镜下观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系，对照有关资料确定真菌的分类学地位［8］。
1.2.5; 对峙试验 将4种植物病原菌(纹枯病菌、稻瘟病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌)接种于平板中央，内生真菌接种于平板边缘，28 ℃培养，观察病原菌菌落周围的变化。
2; 结果。
2.1; 表面消毒效果 表面消毒后的样品振荡液0.3 mL分别涂布于PDA平板培养基上，28 ℃培养2周后无菌落长出，同时10株分离的代表性真菌菌苔分别经过消毒过程处理后接种到PDA平板上，28 ℃培养2周后，没有观察到菌落生长。表明经过样品消毒处理过程，样品表面附生菌的影响已消除，分离的菌株来自于样品内部，与植物组织结合紧密。
2.2; 小连翘内生真菌种群组成 从植物小连翘分离获得内生真菌共81株。经显微形态观察鉴定为4个目，5个科，26个属（见表1）。从表1可以看出，植物小连翘内生真菌中，从目的分类水平上以丛梗孢目(Moniliales)和无孢菌群(Mycelia sterilia)为优势菌群，分别为50株和23株占总菌株数的61.7%和28.4%；在属的分类水平上以头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为优势菌群，分别为20株和16株，占总菌数的24.7%和19.7%。