硝化应激对小鼠肝原代细胞损伤及机制研究
【摘要】目观察硝化应激重要硝化剂氧亚硝基阴离子（）对肝原代细胞体外损伤作用及机制研究。
方法通不浓供体作用肝原代细胞探有效作用剂量加入清除剂处理确认是否是对肝原代细胞产生影响。
将肝原代细胞分rl组作用组和清除剂组用法分别检测各组肝细胞存活率L检测细胞坏死情况r Bl法检测细胞生成印记蛋白——3硝基酪氨酸（3或）表达情况。
结00μ刺激使肝细胞存活率明显下降检测该浓下肝细胞培养基L活性发现也明显升高。
【关键词】硝化应激；肝原代细胞；氧亚硝基阴离子【图分类】R53【献标识码】【编】0099（03）0硝化应激（rvr）[]指机体活性氧簇与活性氮簇共生成增加导致机体产生量硝化能力极强类硝化物质如氧亚硝基阴离子等等进而对机体些蛋白质产生硝化作用或者对细胞核酸物质产生硝化作用进而引起些机体病理变化。
研究发现病理情况下体产生量超氧阴离子等氧化物质体体诱导型氧化氮合酶表达及活性增加催化产生量；与氧化应激反应产物超氧阴离子（）结合产生氧亚硝基阴离子（rxr）等硝化能力很强物质从而使机体产生硝化应激[]体多种途径可导致蛋白质酪氨酸残基硝化其由量与反应生成介导蛋白质硝化被认是主要途径[3]主要是致使机体些蛋白质酪氨酸残基发生硝基化生成硝基酪氨酸（rr）而也被认是硝化应激印记蛋白。
近年研究表明些肝脏疾病程或者病理情况下会导致肝脏发生硝化应激现象[]而硝化应激也被认参与了多种疾病如酒精性脂肪肝病理生理程[5]。
但是对硝化应激是否对肝细胞产生直接作用以及其作用具体机制尚不完全清楚。
项研究采用供体3吗啉斯德酮亚胺（3rl）体外直接作用原代培养鼠肝原代细胞观察对肝原代细胞直接作用并探讨其作用机制。
材和方法 实验动物8周龄健康雄性57鼠由蒙古医科学动物部提供。
主要试剂及仪器主要试剂ll’ 培养基购美国GbBRL公司；胎牛血清（B）购美国l公司；噻唑蓝（）和购美国g公司；005%胰酶、购美国vrg公司；抗购美国b公司；5050四羟甲基（甲基‘吡啶基）铁卟啉（）购美国 l公司；鼠尾胶原购美国B公司；L检测试剂盒购南京建成公司。
主要仪器德国r常温水平离心机美国酶标仪美国Br电泳仪。
3 实验方法3酶消化法取鼠肝原代细胞培养待用将肝细胞以每孔5×03接种96孔培养板每孔加培养基00μl待生长至单层融合低血清（05%B）处理进行不处理。
细胞分组空白对照组作用组（先采用0至500μ刺激细胞终选取00μ作刺激细胞浓）+（0μ）作用组（0μ）单独作用组。
药物作用每孔加入5gL 溶液0μl继续培养弃上清每孔加入50μl二甲基亚砜（）振荡5使结晶物充分溶用酶标仪测定570波长各孔吸光（）值。
细胞存活率处理组细胞值正常对照组细胞值（药物浓0细胞存活率）×00%。
3 L检测试剂盒检测细胞培养基L活性取对照组作用组以及清除剂干预组细胞培养基检测其L活性。
具体方法参照南京建成L活性测定试剂盒说明。
33 r Bl方法检测各组细胞表达水平刮取各组处理细胞用R裂液提取总蛋白。
取每组约80μg蛋白样品进行G。
膜5%B室温封闭加入抗稀释液（000）℃孵育夜。
B洗膜3次每次0再加辣根氧化物酶标记二抗稀释液室温孵育。
B洗膜三次每次0暗室曝光。
采用g G软件扫描各条带灰值进行统计学分析。
统计学处理数据以数±标准差（x±）表示采用0软件进行统计学分析各组比较采用单因素方差分析（ V）L法进行组两两比较。