厄罗替尼对肺腺癌细胞凋亡的影响

作者：白小燕 牟晓燕 姜淑娟 王亚丽 刘庆亮。

【摘要】 目的 研究厄罗替尼对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响以及对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的影响。方法 采用MTT法检测不同浓度的厄罗替尼对A549细胞的增殖抑制作用;以倒置相差显微镜、流式细胞术、TUNEL法及DAPI荧光染色法检测细胞凋亡;以免疫荧光法分析厄罗替尼对EGFR蛋白表达的影响。结果 厄罗替尼抑制A549生长呈时间浓度依赖性;厄罗替尼处理A549后倒置相差显微镜、DAPI及TUNEL均见到明显的凋亡细胞(P0.05);药物处理组使细胞发生明显的G1期阻滞(P0.05);TUNEL检测到200 μmol/L厄罗替尼组细胞凋亡率为(42.13±1.4)%，显著高于对照组(0.82±0.03)%(P0.05);免疫荧光法表明厄罗替尼明显下调EGFR表达(P0.05)。结论 厄罗替尼杀伤A549细胞的机制与介导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期及阻滞EGFR信号途径有关。

【关键词】 厄罗替尼;EGFR;A549细胞;细胞凋亡。

【Abstract】 Objective To explore the effects of Erlotinib on apoptosis andexpression of EGFR in human pulmonary adenocarcinoma cell line A549 cells. Methods MTT assay was used to determine A549 cells proliferation. Inverted microscope, flow cytometry, DAPI and TUNEL were used to detect apoptosis. The expression of EGFR was determined by immunofluorescence. Results Erlotinib inhibited the growth of A549 cells in a dosedependent and timedependent.The cells treated with Erlotinib showed a typical apoptotic morphology (P0.05) and G1 phase arrestting(P0.05). The apoptosis rate of 200 μmol/L Erlotinib group 〔(42.13±1.4)%〕 was significantly higher than that of control group〔(0.82±0.03)%〕 (P0.05). Immunofluorescence assay showed that Erlotinib downregulated the expression of EGFR. Conclusions Erlotinib can kill A549 cells，owing to inducing apoptosis and G1 phase arresting and downregulating the expresion of EGFR.

【Key words】 Erlotinib;EGFR;A549 cell;Cell apoptosis。

表皮生长因子受体(EGFR)在多数恶性肿瘤中常呈过度表达，而在正常细胞中很少表达，多项研究表明40%～80%非小细胞肺癌(NSCLC)存在EGFR过表达〔1〕。EGFR过表达预示存活率低、预后差、转移可能性大，表明EGFR信号转导通路的活化是肿瘤发生的最基本机制〔2〕。因此，从理论上说，利用EGFR抑制剂来治疗EGFR表达阳性的肿瘤应该具有良好的应用前景。厄罗替尼是一种口服的EGFR酪氨酸激酶拮抗剂，通过阻断NSCLC细胞生存、增殖中的某些信号转导通路而发挥作用〔3〕。本实验通过观察厄罗替尼在体外对A549细胞增殖、凋亡及EGFR蛋白表达的影响，探讨其作用机制，为厄罗替尼用于临床NSCLC的治疗提供实验依据。

1 材料与方法。

1.1 细胞及主要试剂 人肺腺癌细胞株A549由山东大学附属省立医院中心实验室提供，胎牛血清(FCS)购自杭州四季清公司，RPMI1640 购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)、DAPI染液购自Sigma公司,厄罗替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)由罗氏公司惠赠。EGFR兔抗人多克隆一抗购自奥博森公司，FITC标记羊抗兔IgG及DAB试剂盒购自北京中杉公司， Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒购自晶美公司。TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司。Labsystems MutisKan Ascent全自动酶标测试仪购自芬兰Labsystems公司,EPICS XL4型流式细胞仪购自美国Beckmancoulter公司。IX51倒置式基础型显微镜Olmpus购自日本。

1.2 细胞培养和分组 人肺癌A549细胞株培养于10% FCS、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的 PRMI1640培养基细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化、计数及传代，1 w传2～3次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。实验细胞分组：正常对照组(A组);低浓度组(厄罗替尼25 μmol/L，B组);中浓度组(厄罗替尼100 μmol/L，C组);高浓度组(厄罗替尼200 μmol/L，D组)。

1.3 药物配制和使用 厄罗替尼用适量DMSO溶解，储存在—20℃，药物活性无改变，每次实验前解冻，用新鲜培养液配成相应工作浓度。所有实验中的DMSO终浓度均小于0.1%，根据Augustine Rauch等的研究成果〔4〕,该浓度的DMSO对实验结果无显著影响 。

1.4 四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测细胞增殖 0.25%的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞，悬浮于含10%FCS的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为5×104细胞/ml，每孔100 μl接种于96孔培养板，5 000细胞/孔，培养24 h后，去上清分别加入含有不同浓度厄罗替尼的RPMI1640培养液100 μl，使厄罗替尼的终浓度为25、100、200 μmol/L。同时设阴性对照组、空白对照组，阴性对照组为只加RPMI1640培养液，空白对照组为不加细胞而只加培养基，每组设3个平行复孔，分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，混匀，37℃孵育4 h后，吸去上清液，加入150 μl的DMSO，振荡培养板10 min，用酶标仪检测每孔490 nm波长吸光度值(OD)，实验重复3次求其平均值。据吸光度值计算细胞抑制率。抑制率(%)=(1—实验组平均值OD490/对照组平均值OD490)×100%，以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。

1.5 细胞凋亡形态学观察 在倒置显微镜下观察培养瓶中细胞的生长状况及形态学改变并拍照。

1.6 流式细胞仪、DAPI荧光染色法及TUNEL染色法检测细胞凋亡。

1.6.1 流式细胞仪 细胞接种在小皿中，37℃孵育24 h后按以上分组方法加药， 48 h后常规胰酶消化制成1×106/ml的单细胞悬液，冷PBS洗2次，1 000 r/min离心5 min,弃去上清，加入结合缓冲液 100 μl,依次加入钙依赖性磷脂结合蛋白(AnnexinⅤ)和碘化丙啶(PI)，常温避光染色15 min，直接加结合缓冲液600 μl，重悬后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6.2 DAPI荧光染色 细胞凋亡观察取经药物处理和未处理细胞涂于载玻片上，滴加DAPI染料(1 μg/ ml，甲醇配制)，常温作用2～3 min，PBS冲洗3次，置荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。

1.6.3 TUNEL凋亡染色 各组细胞爬片用PBS冲洗3次，用新鲜配置的40% 多聚甲醛(PBS溶液配制)室温固定30 min;PBS洗3次，5 min/次;3%H2O2中37℃孵育15 min以封闭内源性过氧化物酶;PBS洗3次，5 min/次;细胞的通透：加入0.2% TritonX100枸橼酸钠缓冲液中冰浴10 min;PBS洗3次，5 min/次;加20 μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃反应60 min;PBS洗3次，5 min/次;信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加25 μl 转化剂POD反应液，在湿盒中37℃孵育30 min;PBS洗3次，5 min/次;加入25 μl DAB底物溶液，室温孵育10 s;自来水冲洗10 min;复染核，脱水、透明、封片、镜检。同一处理随机选择至少10个观察视野，以凋亡阳性细胞数占细胞总数的百分比为细胞凋亡率(%)。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期 细胞以5×105/ml接种24 h，分组加药，48 h后收集细胞，冷PBS漂洗3次，按照细胞周期检测试剂盒说明书操作，最后上机检测，并用Multicycle for windows软件分析细胞周期分布的变化。

1.8 免疫荧光检测EGFR蛋白的表达 将对数生长期的A549细胞接种于含细胞爬片的24孔板内，常规培养，待细胞生长至单层时，24 h后分组加药，继续孵育48 h后，PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，每次5 min。山羊血清封闭30 min，吸弃。分别EGFR一抗(1∶50)4℃湿盒内过夜，FITC标记二抗(1∶50)37℃避光孵育2 h，PBS洗3遍。95%甘油封片后照荧光片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.9 统计学分析 实验数据以x±s表示，用SPSS11.0软件进行t检验、χ2检验和方差分析。

2 结 果。

2.1 药物对细胞增殖的抑制作用 使用不同浓度的厄罗替尼处理对数生长期的细胞24、48、72、96 h后，MTT比色法显示，对照组细胞生长率明显高于各实验组，实验组之间有明显差异。表明厄罗替尼对人肺癌A549细胞生长有抑制作用，且这种抑制作用呈浓度和时间依赖性。见图1。

图1 MTT检测厄罗替尼对细胞生长的抑制作用。

2.2 细胞形态学观察 加药前对照组与实验组A549细胞数量和形态基本一致。48 h后，正常对照组细胞紧密贴壁，边界清楚、透明度高，生长旺盛，可见各期核分裂相;实验组细胞体积缩小，胞内出现颗粒，形态改变，细胞间隙增大，变圆脱落，随药物浓度升高颗粒增多细胞开始碎解，见细胞碎片和凋亡小体。见图2。