四川猕猴桃溃疡病的发生与病原研究
摘要实地调四川5市（县）猕猴桃（ ）发病情况从发病采集染病枝条并分离病原菌进行致病性测定以细菌常规鉴定及基6 r序列分子生物学鉴定等确定病原菌。
病害调显示染病猕猴桃枝干上形成渗出白色或红褐色黏液溃疡；叶片上常形成带黄晕不规则暗褐色病斑且名山和苍溪两地发病情况比起其他三地更严重。
从病枝分离到5株优势菌株鉴定丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（ rg v ）。
病害调观察到症状与细菌性溃疡病症状相似分离得到病原菌与国其他地区报道致。
关键词猕猴桃；溃疡病；丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种；病原菌；四川图分类3663 献标识码 编0398（03）093705rr g Kr Brl kr L Z gbg Bl（ llg rr grlrl vr ’ 650 ； rx Qr Br g 600 ）br B vgg rr kr brl kr v rv g br l r rk kr ll r kr rr g brlgl llr b 6 r q rv rrglr rk br rr ll l r r kr lv kr r rbr x r rk lr g rr gx g r r r r l rrr v l g br r b rg v brv vg r lr brl kr l r l rv rr r rg K r Kr； brl kr ； rg v ； g； 猕猴桃溃疡病是种具有毁灭性细菌性病害0世纪80年代早期日和美国被发现并作了较详细报道[]。
随病相继韩国、伊朗、利等国出现[35]。
国该病早发现湖南[6]便迅速蔓延至四川、安徽、福建等省[79]。
该病害主要危害猕猴桃（ ）新梢、侧枝、主干及叶片造成枝蔓枯死严重甚至整株枯死不仅降低猕猴桃产量而且导致皮厚、酸、色差实品质降低树树势变差严重制约猕猴桃种植。
该病996年被列国森林植物病害检疫对象[0]。
近年四川多地力发展猕猴桃产业建立起规模较种植区但是猕猴桃溃疡病发生直伴随着整产业发展。
了更地四川地区检疫和防治该病研究实地病害调基础上采集5地染病枝条分离鉴定引起该病病原菌以期续防治工作提供理论基础。
材与方法 病害调与病枝采集实地逐株调四川省都江堰市、苍溪县、崇州市、德阳市以及名山县主要猕猴桃栽培区病害发生情况记录发病症状、发病率、调和地等并从发病采集染病枝条。
病原菌分离病原菌分离培养基采用牛肉膏蛋白胨（B）培养基（牛肉膏3 gL蛋白胨0 gL蔗糖0 gL琼脂0 gL 70）。
将各地采集到发病枝条洗净新鲜病健交界处切取 × 块带病斑组织用无菌水冲洗3次分别用75%乙醇和05%～0%次氯酸钠进行表面消毒病组织消毒液浸泡～ 再用无菌水冲洗3次移至装有无菌水培养皿制成菌悬液涂布B培养基5 ℃培养～ 挑取单菌落B培养基上多次划线纯化将纯化分离菌株至B斜面培养基上 ℃保存。
3 标准菌株和对照菌株标准菌株丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（ rg v ）对照菌株丁香假单胞杆菌丁香致病变种（ rg v rg）二者由国林业科学院森林生态环境与保护研究所提供。
标准菌株主要用生理生化指标测定与待测菌株进行对比；对照菌株主要用寄主致病性测定与待鉴定菌株进行对比。
致病性测定 烟草敏性反应测定 将从猕猴桃病枝上分离到5株测试菌株B培养基上8 ℃培养8 用无菌水配制成×09 L菌液用6医用次性射器吸取菌液对5～6叶龄烟草叶片进行下表皮皮下渗入每菌株接3株共9片叶以无菌水对照5 ℃下保湿培养 观察其敏性反应。
对猕猴桃致病性测定 将采四川省雅安市多营镇猕猴桃离体带叶枝条插清水接种先用70%乙醇对枝条表面消毒然用昆虫针5根捆成束蘸取B培养基上8 ℃培养 细菌悬液针刺接种每菌株分别接3根枝条每根枝条接位置以无菌水和丁香假单胞杆菌丁香致病变种作对照。
接种套袋5 ℃保湿培养逐日观察发病情况。
待发病从发病组织进行病菌再分离以完成柯赫氏法则要获得纯培养分离菌株用细菌学性状测定。
5 细菌学性状测定5 病原菌形态特征和染色反应 细菌形态观察采用透射电镜技术。
将供试菌株用无菌水配制成浓×07 L菌液滴滴铜上室温下吸附5 滤纸吸干再加%磷钨酸染～ 吸多余液体待干日立600型透射电镜下观察菌体形态、鞭毛数目和着生位置。
按常规进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色置光学星微镜下观察。
5 培养性状观察 供试菌株B培养基上8 ℃培养 观察菌落性状特。
聚糖产生试验配制含蔗糖培养基（蛋白胨0 gLl 5 gL蔗糖 50 gL琼脂0 gL 70～7）和含葡萄糖培养基（蛋白胨0 gLl 5 gL葡萄糖 50 gL琼脂0 gL 70～7）。
分别两种培养基上划线培养观察菌落形态。
KB产荧光试验供试菌株KB培养基（甘油 0 gL胰蛋白胨0 gLK 5 gLg·7 5 gL琼脂 0 gL 7）上培养3 紫外灯下观察。
53 病原菌生理生化测定 主要生理生化测定参照献[]、[]等进行以无菌水和标准菌株作对照。
6 基6 r序列分子鉴定6 供试菌株基因组提取 挑取纯化单菌落移植至LB液体培养基（胰蛋白胨0 gL酵母提取物5 gLl 0 gL）5 ℃下50 r摇床培养夜。
然使用天根生化科技有限公司生产细菌基因组提取试剂盒提取各参试菌株基因组。
6 供试菌株6 r序列R扩增 根据已发表植物病原细菌6 r通用引物[3]（75′GGGGGG 3′；9r5′GGGG3′）对各供试菌株进行R扩增。
R反应体系总体积50 μL含5 μL rx q（日宝生物工程有限公司） μL引物7 μL引物9r5 μL 模板补足总体积。
反应混合液95 ℃预变性 ；9 ℃变性 56 ℃退火 7 ℃延伸 共35循环；7 ℃延伸7 ℃保存。
反应结束取5 μL R产物5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测检测将R产物送至上海生工生物工程有限公司测序。
63 序列比对及系统发育树构建 将获得测序结GBk数据库进行BL序列比对从选取相似序列使用G 0和lrl X软件完成序列匹配采用邻接法进行聚类分析构建系统发育树。
结与分析 调地病害发生情况及比较0年3月下旬至月下旬进行实地症状观察图、图分别显示是名山县和苍溪县病株溃疡病发病症状。
病株分枝处表现出型溃疡病腐烂症状发病部位裂缝及其附近区域颜色赤褐色从裂缝及邻近病斑皮孔处分泌出量菌渗物菌渗物淡褐色胶状黏性液体流胶处树皮也变成黑色。
细心观察可以发现病部周围还存白色粒状菌露。
标观察。
图3、图和图5分别采崇州市、德阳市和都江堰市病株标这些病株病部出现许多赤锈色其皮层组织也呈赤褐色。
剥开树皮可见到褐色坏死导管组织及其邻近变色区皮层被侵染皱缩干枯；病株上形成 ×3 左右裂缝周围渐愈伤组织。
叶片发病（图6）先形成红色外围可见不明显黄色晕圈形成～3 不规则褐色到暗褐色病斑可见宽约～5 明显黄晕潮湿条件下扩成多角形水渍状斑。
统计5调地苍溪、名山两地发病严重发病率达30%～0%而其他3地发病相对较轻发病率5%左右。
究其原因可能是由苍溪县相对崇州市、德阳市和都江堰市3四川部城市处偏东北山地山地相对部盆地更冷湿冬寒夏凉年温低部地区；名山县地处四川偏西南地区也处山地且常年多雨年温样低这3地而猕猴桃溃疡病易阴冷潮湿环境发生。
因推测气候、地理原因可能是造成两地区发病更严重主要原因。
猕猴桃溃疡病病原菌分离从采集病株样共分离得到株疑似病原菌菌株选取其型5株作供试菌株将其编0、X9、33、Z8、6。
3 致病性测定3 烟草敏反应 烟草敏反应测定结（图7）显示烟草叶片接种供试菌株 全部出现枯斑证明有敏反应。
3 对猕猴桃致病性测定 对猕猴桃致病性测定结（图8）表明供试菌株接种到猕猴桃枝干上9～6 接种处出现明显染病症状其具体特征是枝干接种处病变流出黄色汁液随颜色由浅变深变成深红和锈红色这是菌溢体氧化结。
感病部位韧皮部细胞坏死组织褐变芽体不发枝条枯干。
分离病组织然重新回接到猕猴桃枝条上其表现出相症状。
对照株接种见发病。
细菌学性状 细菌形态特征和染色反应 透射电镜和革兰氏染色反应镜检（图9）表明菌体短杆状少数稍弯曲6～30 μ×035～050 μ多数根鞭毛极生少数～3根。
病原菌革兰氏染色阴性不具荚膜不产生芽孢。
培养性状观察 B培养基上菌落圆形略微隆起乳白色边缘全缘表面光滑半透明；菌落生长速较慢培养 菌落仅有针尖培养36 菌落直径075～0 ；KB培养基上不产生荧光；蔗糖培养基上菌落黏液状表明有聚糖产生。
5株供试菌株氧化酶试验、精氨酸双水酶试验和马铃薯软腐试验结显示阴性无冰核活性产氨耐盐力3%～%不液化明胶不能使硝酸盐还原石蕊牛乳反应呈弱碱性能利用相糖类和氨基酸。
所有生理生化指标测试结与标准菌株致。
5 基6 r序列分子鉴定按照6方法提取各供试菌株基因组电泳检测提取样品条带高亮清晰无拖尾现象表明质量较高可直接用R反应。
用6 r通用引物扩增参试菌株得到约 500 b清晰条带合预期扩增特异性较高。
通对测序结进行BL比对结显示供试5菌株6 r序列与B上菌株（GBk B0039）性都达到99%以上。
从GBk选取相似菌株利用G0软件构建系统发育树（图0）结表明5株供试菌株分支上并与B数据库标准菌株聚类且置信达89%。
983年美国gr[]鉴定确定该病病原菌丁香假单胞菌李致病变种（ rg v rrr）。
98年日曾报道丁香假单胞菌丁香致病变种（ rg v rg）猕猴桃溃疡病病原菌[]。
989年日kk等[]将病原菌认定丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（ rg v ）。
rg v rrr致病菌对猕猴桃致病力比较弱接种产生溃疡症状不明显而 rg v 对猕猴桃有较强致病力除了枝蔓上接种能够表现出型溃疡病症状外花及叶片上也能致病表现出溃疡病症状。
王忠肃等[5]、梁英梅等[6]和承河元等[8]分别对四川、陕西和安徽猕猴桃溃疡病进行病原鉴定也认其病原丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种。
前人研究表明引起猕猴桃溃疡病病原细菌致病变种有不这可能与地理分布有关。
近年国外报道都倾向将猕猴桃溃疡病病原菌确定 rg v [9]不仅从形态学、生理生化方面得到了验证更重要是得到了分子层面佐证[78]。
研究从四川省5市（县）猕猴桃染病猕猴桃枝条分离到病菌对猕猴桃致病力强些关键生理生化指标及形态特征、染色反应、致病性测定和分子鉴定与国外报道丁香假单胞菌猕猴桃致病变种致。
研究结表明引起四川猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
参考献[] RZ K KK l rr brl kr kr r l g rg br[] l lgl 98955（）733[] GR kr kr[] l 98367（）838[3] K L kr kr b rg v rrr[] Kr rl l lg 9989[] ZR R r rr brl kr kr r[] l lg993055056[5] R rr rg v kr l[] l lg993035038[6] 方炎祖朱晓湘廖新光湖南猕猴桃病害调研究[]四川树科技990（）89[7] 刘绍基唐显富王忠肃等四川省苍溪猕猴桃溃疡病发生规律[]国树996（）56[8] 承河元李 瑶万嗣坤等安徽省猕猴桃溃疡病菌鉴定[]安徽农业学学报995（3）98[9] 林尤剑 高日霞 福建猕猴桃病害调与鉴定[]福建农业学学报995（）9[0] 刘丽珍初 冬李有忠等猕猴桃细菌性溃疡病危险性分析[]灾害学007（）99[] 任欣正 植物病原细菌分类和鉴定[]北京农业出版社99[] 方达植病研究方法 []三版北京国农业出版社998[3] L R RL lr r 6 rR g rr r vrl l g Vbr[] rblg0083339[] KK RZ K l rg v l br kr kr [] l lgl 98955（）37[5] 王忠肃唐显福刘绍基猕猴桃细菌溃疡病（ brl kr）病原细菌鉴定[] 西南农业学学报99（6）500503[6] 梁英梅张星耀田星明陕西猕猴桃枝干溃疡病病原菌鉴定[] 西北林学院学报0005（）3739[7] K rkr r rg v [] ll ll00 33093[8] GRG R V L R l rg v g lr r （R） rr b 63 r rrrb r rg r R rr b r g rg[] l lg005936