CCK8对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析
作者：刘晓燕 李洪 李娟 王丽 段承刚 陶忠桦 何涛。
【摘要】 目的 探讨八肽胆囊收缩素（CCK8）对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的保护作用。方法 检测CCK8对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠模型的刺激前后血糖和血清胰岛素的水平，采用双向电泳并结合生物信息学方法，观察刺激前后胰腺组织蛋白质表达的差异。结果 初步确定了CCK8刺激引起胰岛细胞JIP1、RBBP7、PP2AB、PDX1、BCLX 5种蛋白质的表达明显增强，这些蛋白在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激胰岛素基因表达等方面发挥重要作用。结论 CCK8可能通过刺激特异蛋白质的表达，对糖尿病大鼠受损胰岛细胞起到一定的保护和恢复作用。
【关键词】 CCK8；糖尿病模型；胰岛细胞；蛋白质表达；大鼠。
胆囊收缩素（CCK）是广泛分布于胃肠道及中枢和周围神经系统一种典型的脑肠肽，具有生物学功能的多样性，CCK8是具有CCK完全功能的最小活性片段，在种属间具有相对保守性。研究发现CCK有明显的刺激胰岛素分泌的作用，也是调节胰腺细胞再生的主要胃肠激素〔1，2〕。近来的有关CCK8治疗2型糖尿病的研究显示，CCK及其类似物是极具潜力的2型糖尿病的治疗药物〔3～5〕。但目前有关CCK对于糖尿病胰岛细胞损伤是否具有保护作用及其机制还知之甚少。本研究在建立糖尿病大鼠模型的基础上，采用双向电泳等技术观察CCK8是否通过刺激特异性蛋白质的表达，进一步深化对CCK8胰腺保护作用的认识，拓展CCK及其类似物在2型糖尿病治疗中的应用提供实验依据。
1 材料与方法。
1.1 动物及主要试剂。
SD大鼠（重庆腾鑫生物技术有限公司）；CCK8和链脲佐菌素 (STZ)购自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、超纯尿素、二硫苏糖醇、CHAPS、甘氨酸、甲基乙二胺(TEMED)、磷酸三丁酯(TBP)、过硫酸铵（APS）、十二烷基磺酸钠（SDS）、固相pH梯度干胶条（pH 3～10，17 cm）和矿物油均购自BioRad公司；枸橼酸钠购自中国上海试剂一厂；蛋白分子量Marker和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自碧云天生物技术研究所；125I胰岛素放射免疫试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。
1.2 实验方法。
SD大鼠68只，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。糖尿病模型组大鼠禁食10 h，按55 mg/kg腹腔内注射STZ溶液（用0.1%无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2%溶液，调pH=4.5，过滤除菌）。
1.2.2 CCK8的注射。
随机取对照组和糖尿病模型组大鼠各30只，腹腔内分别注射生理盐水0.1 ml或10—6mol/L CCK8 0.1 ml，于1、2及3 d后各时间点处死大鼠10只，取血清及胰腺组织—80℃冻存待用。
1.2.3 血清胰岛素及血糖的测定。
各组血清胰岛素浓度采用125I放射免疫法进行检测。各组SD大鼠于造模前后和给药前后采用血糖仪（德国罗氏诊断公司）检测尾静脉血血糖浓度。
1.2.4 蛋白样品的制备。
取50 mg胰腺组织加入300 μl裂解液（8 mol/L尿素+0.2%Biolyte+0.1%CHAPS+15 μl PMSF），剪刀剪碎并用小圆头玻棒研磨，冰上裂解30 min，12 000 r/mim离心60 min。取上清液用Bradford法测蛋白浓度，分装，—80℃冻存。
1.2.5 蛋白质组双向电泳分离。
分别取各组蛋白样品800 mg，加水化液（裂解液+DTT 0.01 g/L+Biolyte 5 μl/ml+0.1%溴酚蓝10 μl）至总量300 μl/胶条，混匀后加入水化槽，将胶条放置1 h后加入矿物油覆盖过夜。将水化后的胶条转移至等电聚焦电泳系统(BioRad)，于17℃进行聚焦，程序设置为250 V，30 min →1 000 V，1 h → 10 000 V，5 h → 10 000 V，6 h → 250 V，2 h，总伏时数约为8万伏时。取出胶条，加入平衡液（6 mol/L尿素+2％SDS+20％甘油+0.375 mol/L TrisHCl，pH=8.8）+20%DTT，平衡15 min；再将胶条小心放于10%分离胶顶端，用0.5%的琼脂糖（含少量溴酚蓝）封闭胶条进行第二向SDSPAGE电泳，电泳参数为10 mA/胶条，1 h；以后为20 mA/胶条。待溴酚蓝接近分离胶底端时停止电泳。
1.2.6 考马斯亮蓝染色 按常规方法进行。
1.2.7 凝胶成像及双向电泳图谱分析。
将染色后的凝胶置ChemiDoc XRS凝胶成像系统(BioRad)中照相成像。采用ImageMaster 2D Platinum(Amersham)双向电泳图谱分析软件进行斑点自动识别、定量检测及匹配对比分析。获得各蛋白斑点的实验等电点（pI）和分子量（MW），结合组织表达特异性，采用TagIdent工具软件检索SWISSPROT蛋白数据库，对蛋白斑点进行初步鉴定。
1.3 统计学分析。
数据用x±s表示，组间比较采用t检验。采用SPSS11.0统计软件分析处理数据。