川芎嗪对小鼠小细胞肺癌血管生长和VEGF表达的抑制
【摘要】 目的 观察川芎嗪对实体肿瘤及其血管生长的抑制作用及作用环节。方法 用C57BL小鼠接种小细胞肺癌细胞造模,川芎嗪注射液100、200 mg/kg/d腹腔注射,21 d后检测肿瘤体积、重量及微血管密度,并用Western Blot 法和免疫组化法分析肿瘤细胞VEGF的表达。结果 川芎嗪能减少小鼠小细胞肺癌肿瘤体积、重量, 降低肿瘤微血管密度, 抑制肿瘤细胞VEGF的表达。结论 川芎嗪能抑制小鼠小细胞肺癌的生长,其机制可能与抑制VEGF表达、降低肿瘤微血管密度有关。
【关键词】 川芎嗪 小细胞肺癌 微血管密度 血管内皮生长因子。
恶性肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤组织中新血管生成, 抑制血管生成能抑制肿瘤的生长和转移[1]。肿瘤细胞能够分泌多种血管生成因子,其中血管内皮生长因子(VEGF)是高效、高特异性作用于血管内皮的促血管生成因子,与肿瘤的生长和转移密切相关[2]。川芎是著名的活血、化瘀、抗肿瘤中药。已知川芎嗪可以抑制肿瘤的生长,其机制与其促进免疫功能有关[3]。川芎素(阿魏酸钠)抑制人肺癌A549细胞增殖,其机制与诱导细胞凋亡有关[4]。本试验观察川芎嗪对小鼠小细胞肺癌的抑制作用以及对肿瘤微血管密度和VEGF表达的影响,旨在探讨活血化瘀中药可能存在的其它作用及其机制。
1 材料与方法。
1.1 药品与试剂。
盐酸川芎嗪注射液（TMP，4 mg/2 mL/支，北京市第4制药厂）,硫酸鱼精蛋白注射液(PTM, 50 mg/5 mL/支,上海生物化学制药厂), VEGF抗体和Ⅷ因子抗体（Santa Cruze 产品），SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其余试剂均为市售分析纯。
1.2 动物分组与造模[5] 取40只18～20 g的C57BL小鼠(购自中国医科大学实验动物中心), 雌雄各半,随机分为4组，川芎嗪1、2组、鱼精蛋白组(阳性对照)、生理盐水组(NS)。
取接种小细胞肺癌细胞（购自中国科学院细胞库)14 d的C57BL荷瘤小鼠脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织加生理盐水研磨成匀浆,调细胞浓度后,每只正常C57BL小鼠右臀部皮下接种1×107个小细胞肺癌细胞。
1.3 实验方法。
川芎嗪组剂量分别为100、200 mg/kg , 生理盐水组每只0.2 mL,接种后第2天开始用药, 每天1次, 腹腔注射连续21 d;鱼精蛋白组60 mg/kg,接种后第2天皮下注射1次,第3天起每12小时1次,连续20 d。第22天脱颈椎处死各组小鼠进行检测。
1.4 一般检测。
接种前和接种后每3天称量1次体重,按体重变化调整给药剂量。接种后每3天用游标卡尺测量1次荷瘤小鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b),按V =0.5ab2计算肿瘤体积,第22天 处死小鼠,取接种部位肿瘤称重,计算肿瘤生长抑制率〔肿瘤生长抑制率(%)=(生理盐水组平均瘤重—治疗组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%〕。
1.5 免疫组化染色。
取肿瘤组织,固定、脱水、包埋,4 μm连续切片,VEGF抗体或Ⅷ因子抗体为Ⅰ抗,阴性对照用PBS代替Ⅰ抗,按照试剂盒说明书进行SABC法免疫组织化学染色。
1.6 VEGF 表达的定量分析。
选取阳性细胞密集区域,在400×显微镜下选取20个阳性细胞,用图像分析系统测定平均吸光度(A值),以此代表阳性细胞胞质单位面积内VEGF 相对含量。
依据Weidner[1]标准对着染的血管进行密度分级。高血管密度区多位于肿瘤边缘。在200倍镜每0.74 mm2的视野下,以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的棕黄色内皮细胞或细胞丛作为一个微血管,记录5个视野内的微血管数,取其平均值。
1.8 Western Blot。
参照文献[6],取肿瘤组织,溶于Laemmlis溶解缓冲液中(1% Triton X—100,1 mmol/L PMSF,21 mg/L aorotinin,0.5 mg/L leupeptin,1% SDS)，离心后将上清液移于另一试管中。Lowry法检测溶解液中蛋白含量。加入2×SDS加样缓冲液(125 mmol/L Tris—HCl，20%甘油,0.01%溴酚蓝,4% SDS,200 mmol/L DTT)，置沸水浴中加热5 min,按每孔30 μg蛋白量加样进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶在转移缓冲液(25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸,20%甲醇) 中转移至硝酸纤维素膜,然后将膜浸没于含5%脱脂奶粉的TBST液中封闭。Ⅰ抗、Ⅱ抗分别与膜孵育,显影,NIH image1159计算机软件分析条带。