大黄虫丸对肺纤维化模型形成阶段肺组织TNF—α表达的影响
作者：李瑞琴，宋建平，李伟，张瑞，张丽敏，张现伟。
【摘要】 目的探讨大黄虫丸防治肺纤维化作用及机理。方法用平阳霉素诱导大鼠肺纤维化模型后，第14天开始用药组每天灌胃大黄虫丸，第28天后处死各组大鼠，观察、比较各组大鼠肺部病理组织学改变及肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF—α）表达。结果模型组大鼠肺纤维化程度、肺组织中TNF—α表达均明显高于正常对照组及用药组(P0. 05)。结论大黄虫丸能明显减轻平阳霉素所致的大鼠肺纤维化程度，并能抑制肺组织中TNF—α过度表达。
肺间质纤维化是多种肺间质疾病发展到晚期的一种常见病理变化。虽然导致肺纤维化的原因不同,但其病理变化都从肺泡炎开始。一般认为肺纤维化改变是不可逆的, 西医治疗肺纤维化首选糖皮质激素，但只有部分如非特异性间质性肺炎（NSIP）和脱屑性间质性肺炎（DIP）等对激素反应较好，另一方面长期大剂量应用激素必将引起严重的代谢紊乱、免疫抑制和继发感染等不良反应，故防治肺纤维化药物的研究日益成为国际肺科学界关注的热点。近年来中药治疗肺纤维化报道较多，取得可喜成效，已被列入中华医学会肺纤维化防治方案中。本实验在有关文献和既往课题研究的基础上, 观察了大黄虫丸对肺纤维化疾病模型的肺部病理损害和肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF—α)表达的影响, 对肺纤维化的发病机制和大黄虫丸对肺纤维化的干预机制进行探讨，为肺纤维化的中医药防治研究提供参考依据。
1 材料与仪器。
1.1 动物普通级健康Wistar大鼠48只，雌性，体质量180～220 g，由河南省动物实验中心提供，动物批号：0001432。饲养于河南中医学院动物实验中心，室温（22±2）℃，相对湿度60%，常规饲料喂养，饮水量不限。
1.2 主要药物、试剂与仪器。
平阳霉素:天津太河制药有限公司,批号07010203。大黄虫丸:湖南九芝堂制药厂,批号070602。泼尼松片:浙江仙琚制药股份有限公司,批号:070608。兔抗人、鼠TNF—α多克隆抗体：武汉博士德生物工程有限公司，产品编号：BA0431。即用型SABC免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司, 产品编号SA1022。 DAB显色试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司,产品编号ED1022。HPIAS—1000高清晰度彩色病理图文分析系统:同济医科大学千屏影像工程公司。
2 方法。
2.1 动物分组。
将动物随机分为4组：正常对照组、模型对照组、大黄虫丸组、泼尼松对照组，各组动物均为12只。
2.2 动物造模与用药。
本实验选用大鼠气管内一次性注入平阳霉素复制肺纤维化模型［1］。除正常对照组正常饲养不作任何处理外，模型对照组及用药组按文献方法造模，以水合氯醛腹腔麻醉大鼠，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝型分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺注入平阳霉素生理盐水溶液0.15 ml/100 g（平阳霉素3 mg/kg体质量），立即将动物直立并行旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，缝合皮肤，待动物自然清醒后置笼内常规饲养。从造模后第14天开始，用药组分别灌胃药液1.5 ml/100 g体质量，模型组灌入等量生理盐水。每天给药1次，每周复查动物体质量以调整给药量，各组于第28天处死。造模用药平阳霉素按3 mg/kg进行给药,使用时用生理盐水配制成2 mg/ml,按0.15 ml /100 g气管内给药。其他药物根据临床常用药量,参照动物与人体表面积折算系数计算动物每日用药量大黄虫丸1.2 g/kg,泼尼松片4 mg/kg体质量,上述药物使用时用蒸馏水配制。
2.3 检测方法。
2.3.1 观察实验。
动物一般情况体质量、饮食、皮毛、活动状况等。
2.3.2 肺脏形态学观察。
实验结束时称取动物体质量，腹主动脉取血处死动物,完整摘取肺脏,肉眼观察脏器病变情况。
2.3.3 肺脏病理组织学检查。
取右肺下叶固定、脱水、包埋、切片,分别进行HE、VG染色和免疫组织化学检查。对HE、VG染色的切片参照文献［2］将肺泡炎或肺纤维化程度分级: 0级无肺泡炎或无纤维化;Ⅰ级:轻度肺泡炎或纤维化,受累面积少于全肺的20%;Ⅱ级:中度肺泡炎或纤维化,受累面积20%～50%;Ⅲ级:重度肺泡炎或纤维化,受累面积50%。
2.3.4 肺组织TNF—α检测。
采用免疫组织化学法。用HPIAS—1000计算机图象分析系统对染色后的切片进行定量分析，计算每张切片阳性细胞染色程度，免疫组化切片以细胞胞浆中呈清晰棕黄色为阳性。在高倍镜下观察，随机选上、下、左、右、中央5个视野，测量目标区域的平均光密度。
2.4 统计学处理。
数据采用SPSS 13.0统计软件处理，所用的统计检验均采用双侧检验，P值小于0.05将被认为所检验的差别有统计意义。对服从正态分布的组间计量资料数据以±s表示，组间差异性判断采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett T3检验，肺纤维化程度为等级计数资料，采用Radit分析，以R值表示，组间R值的显著性检验采用t检验。
3 结果。
3.1 一般情况正常对照组大鼠活泼好动，强壮肥硕，皮毛光滑，体重逐渐增加，呼吸平稳；模型对照组精神不振，行动迟缓，拱背蜷缩，皮毛干枯稀疏、无光泽、多见倒竖现象，身体较其它组消瘦，呼吸急促；泼尼松对照组开始尚可，后期出现皮毛干枯，反应迟钝，活动及饮食均减少，部分体重下降；大黄虫丸组皮毛尚可，身体较壮，饮食较正常。
3.2 肺组织病理学检查。
3.2.1 肺整体形态观察正常对照组肺外观无明显异常，呈粉红色，表面光滑；模型对照组表面凹凸不平，呈暗红色，边缘有点状出血，部分肺叶体积缩小，表面有大小不等的灰白色结节。大部分动物肺脏体积缩小，弹性明显降低，表面条索状凹沟。组间比较，泼尼松对照组与大黄虫丸组双肺色泽、体积、硬度、弹性、结节样改变等情况有所好转，两肺颜色略暗红，双肺表面较模型对照组光滑，大部分动物肺脏弹性尚可，部分肺叶偶尔可见散在的点状灰白色斑块。